生鮮乳中β-內酰胺酶微生物法檢測

李欣南，韓鐫竹，蘇崴藝

（遼寧省獸藥飼料畜產品質量安全檢測中心，沈陽110016）

0 引言

生鮮乳是當前百姓生活中不可缺少的食品之一，但是隨著飼料產品及投入成本的增加，造成許多不法商販向生乳中摻入糊精、三聚氰胺、植物末和β-內酰胺酶等有毒有害物質[1-3]，給消費者的身體健康帶來潛在的危害。其中β-內酰胺酶是微生物產生的，主要作用于β-內酰胺類抗生素的一類酶。該酶的使用掩蓋了牛奶中實際含有的抗生素，使青霉素、頭孢菌素等抗生素藥物耐藥性增高，長期使用的危害還沒有明確的報道，但是作為細菌耐藥性機制之一，其有可能誘導人體內正常菌株的耐藥性的產生，從而降低人們抵抗傳染病的能力。

1 β-內酰胺酶檢測方法及原理

現階段，生鮮乳中β-內酰胺酶的檢測方法采用的是衛生部制定的《乳及乳制品中舒巴坦敏感β-內酰胺酶類物質檢驗方法杯碟法》[4-5]，該方法可以檢測出生鮮乳中未反應完全的β-內酰胺酶，可用于檢測未經過任何加工的牛奶，并且檢出限較低，容易區分外源性和內源性β-內酰胺酶。其檢測原理是以一種對青霉素高度敏感的細菌作為指示菌，實驗時如果被測牛奶樣品含有青霉素酶，破壞了青霉素，指示菌株即可生長，否則指示菌將被抑制。同時，通過與標準品比對抑菌圈的大小，可以定量地確定β-內酰胺酶的含量[6-7]。崔生輝等[8]運用β-內酰胺酶特異性抑制劑舒巴坦建立了該酶的檢測方法，該方法在牛奶中的檢出限為4 U/mL。目前，微生物法仍然是實驗室檢測牛奶中β-內酰胺酶的主要方法。

2 方法

參照農業部指定的《乳及乳制品中舒巴坦敏感β-內酰胺酶類物質檢驗方法杯碟法》[4]。

2.1 標準物質控制[9]

（1）青霉素的工作液的制備。青霉素標準品應按百分含量折算后進行稱量，標準溶液應當現用現配，確保容量瓶無殘留，防止交叉污染。

（2）舒巴坦工作液的制備。舒巴坦的標準溶液配制后可分裝冷凍保存一周，避免反復凍融，配制時應確保容量瓶無殘留，防止交叉污染。

（3）β-內酰胺酶工作液的制備。β-內酰胺酶標準品應進行活力測定或購買標注活力單位的標準品。β-內酰胺酶活力測定參見中國獸藥典一部附錄128—青霉素酶及活力測定法，配制及洗刷時應單獨操作，避免污染容器和操作界面。一般工作液濃度應控制在4000～6000 U/mL。

2.2 菌種控制

采用對青霉素類藥物絕對敏感的標準菌株藤黃微球菌（CMCC(B)28001），實驗菌株應來自認可的國內或國外微生物菌種保藏機構的標準菌株或使用與標準菌株所有相關特性等效的商業派生株。剛購置的菌種凍干粉應在-20℃冷凍保存，臨用前活化，標準菌株的復活或培養物的制備應按照供應上提供的說明或按已驗證的方法進行。活化后的菌種為標準儲備菌株應制備培養液，分裝后于-20℃以下甘油冷凍保存。標準儲備菌株可用于制作每月或每次實驗用的工作菌株，工作菌株應在營養瓊脂斜面保存，一般可冷藏保存1個月。

菌種傳代使用營養瓊脂斜面，培養溫度為28℃培養48 h。傳代后菌株在斜面上應為濕潤密布生長，無褶皺和裂紋，亮黃色菌苔。菌種傳代不宜超過14代。14代后菌種的活力下降會給檢驗結果帶來誤差。超過14代應重新挑取液體保存菌種重新傳代。

2.3 器皿控制

檢測中所用器皿及耗材，如培養皿、試管、牛津杯等應清洗干凈，不得有清潔劑等抑菌物質殘留。

（1）實驗用培養皿。培養皿應為內徑為90 mm的玻璃平皿，高度應大于20 mm，避免加入牛津杯后總高度高出平皿邊緣。

（2）實驗用陶土蓋。由于陶土蓋受潮后會變形，因此在每次使用前應挑出不符合規定的陶土蓋，高溫干熱滅菌180℃維持2 h，以除去分和殺滅污染的微生物。

（3）實驗用牛津杯。牛津杯應徹底清洗，避免蛋白質和脂肪等物質殘留牛津杯內壁，影響樣品的滲透。使用前應使牛津杯在無菌條件下自然冷卻后備用。使用后的牛津杯應先超聲清洗30 min，然后使用柔軟試管刷徹底清洗牛津杯內壁，蒸餾水沖洗干凈后晾干，180℃維持2 h高溫干熱滅菌。

2.4 試劑和培養基控制

（1）無菌水和PBS。采用滅菌的無菌水作為樣品的稀釋劑，同時也作為空白樣品，用以確證沒有引入污染。pH值為6.0磷酸鹽緩沖液使用滅菌蒸餾水配置，用于稀釋β-內酰胺酶標準品、青霉素標準品和舒巴坦標準品。

如空白樣品平皿出現陽性結果則無菌水可能被污染，應重新配置、檢測。

（2）培養基。菌種培養使用營養瓊脂培養基，工作培養基使用抗生素Ⅱ號培養基。培養基的驗證、配置參見《SN/T 1538.1培養基制備指南第1部分實驗室培養基制備質量保證通則》和《SN/T 1538.2培養基制備指南第2部分培養基性能測試實用指南》。

2.5 操作步驟控制

2.5.1 工作菌懸液的制備

用0.85%的無菌生鮮乳將斜面上的菌苔潤洗，使用移液管反復吹洗至均勻分散，至終濃度約為1×1010cfu/mL，菌懸液可放置4℃保存1周。菌懸液使用時可提前放置37℃水浴鍋中預熱，防止與抗生素培養基Ⅱ混合時造成培養基凝固。

2.5.2 工作平皿的制備

用于傾倒平皿底層的抗生素培養基Ⅱ，應充分融化并保溫于55±5℃恒溫水浴中，傾倒底層體積為10 mL，傾倒后應放置一段時間使瓊脂充分凝固同時表面的水蒸氣充分揮發后，加蓋備用。

用于傾倒上層的抗生素培養基Ⅱ，應充分融化并保溫于55±5℃恒溫水浴中，傾倒上層體積為5 mL。水浴溫度太高影響細菌生長，太低瓊脂易凝固成小顆粒，傾倒平面后培養基表面凸凹不平，加入牛津杯后，表面與牛津杯接觸有空隙，會產生漏液的現象。培養基在恒溫后加入適量菌懸液并充分混勻，避免結果產生誤差。

2.5.3 樣品的制備

（1）樣品應放置-20℃以下冷凍保存，不宜反復凍融。避免因細菌污染造成的結果誤差。

（2）每次取樣時應注意避免帶入生鮮乳中固體物質而影響加樣和樣品的滲透。

（3）建議樣品的pH值應控制在7.6～8.0，此條件下一些嗜酸性微生物往往不易生長。

（3）樣品中標準物質的加入順序不能改變。

（4）每次加入標準物質都應更換新的槍頭避免交叉污染。

（5）每種標準物質加入后應及時振蕩，使其充分溶解。

（6）樣品制備好后，應立即加樣。

（7）每次實驗應使用無菌水作為空白。

2.5.3 加樣

（1）工作臺面應保持水平，且不能震動。

（2）牛津杯放置時牛津杯間的距離應均一，避免影響結果測量，建議使用牛津杯放置器。牛津杯放置后盡量不要移動。

（3）加樣時間不宜超過20 min，即從在工作平皿中加入牛津杯到加入樣品的時間。

2.5.4 培養

恒溫培養箱內的底板應保持水平，防止因底板不平而造成的漏液。培養溫度37±1℃培養箱內的溫度應均一，避免因溫度不均勻而影響工作菌株的生長，造成結果的誤差。

3 結果

使用游標卡尺或抑菌圈測量儀測定抑菌圈的大小并記錄結果。三個平行樣的結果應平行，0.5μg/mL的青霉素抑菌圈的大小應控制在18～22 mm之間，過大或過小應調整工作菌濃度。圖1為正常狀態下陰性對照水的結果，圖2為陽性樣品的結果。

（1）當空白結果異常時：①如果A、B、D都沒有圈，可能是青霉素標準品失效，應該更換青霉素標準品；②如果A沒有圈，B、C、D正常，則可能是污染，應重新檢測；③如果B沒有圈，A、C、D正常，則可能是污染，應重新檢測；④如果C有圈，可能是β-內酰胺酶失效，應該更換酶儲備液；⑤如果D沒有圈，A、B、C正常，則可能是β-內酰胺酶與舒巴坦比例不合適，應調整使β-內酰胺酶與舒巴坦恰好作用；

圖1 陰性對照水結果

圖2 陽性奶樣結果

（2）當空白結果正常，樣品中如果A、B和D沒有圈，可能是樣品中β-內酰胺酶含量過高，應將樣品稀釋。

4 討論

杯碟法檢測生鮮乳中的β-內酰胺酶雖然操作繁瑣，但其準確性卻很高，只要嚴格控制標準物質和操作步驟，均能得到滿意的檢測結果。本文主要針對生鮮乳樣品，闡述了標準物質控制、樣品制備和具體操作等各個環節的注意事項，尤其是樣品的制備和結果判讀的幾點經驗之談可為實際操作者提供較好的參考，避免結果的誤判。

[1]沈赟,符曉梅,喬昕，等.南京市乳制品中β-內酰胺酶類藥物殘留狀況調查[J].江蘇預防醫學,2010,21(4):6-8.

[2]王榮耕.使青霉素重振雄風的β—內酰胺酶抑制劑[J].精細與專用化學品,2000,8(18):16-17.

[3]馬景宏,張旭,趙虹，等.沈陽市售乳制品中β-內酰胺酶殘留狀況初探[J].中國微生態學雜志,2012,24(007):606-608.

[4]乳及乳制品中舒巴坦敏感β-內酰胺酶類物質檢驗方法杯碟法[S].衛生部公報，2009,7:25-28.

[5]李延華,王偉軍,張蘭威等.微生物法檢測生鮮乳中β-內酞胺類抗生素殘留的對比研究[J].中國抗生素雜志，2009,34(1):63-64.

[6]陳號,馬文靜,田晉紅，等.牛奶中非法添加β-內酰胺酶的檢測方法及研究現狀[J].畜牧與飼料科學，2010,31(1):67-69.

[7]鄧冬云,陳萍,邵昭明，等.牛奶中β-內酰胺酶兩種檢測方法的比較[J].職業與健康，2012,28(5):548-349.

[8]崔生輝,李景云,馬越，等.“生鮮生鮮乳抗生素分解劑”的鑒定與檢測[J].中國食品衛生雜志，2007,19(2):113-116.

[9]馬玉華.關于《乳與乳制品中舒巴坦敏感β-內酰胺酶類藥物檢測方法—杯碟法》的經驗探討[J].中國衛生檢驗雜志,2010(010):2621-2621.