三種柱前衍生化法測定乳粉中牛磺酸含量的方法比較

袁輝，高帥，王傳興

（新疆產品質量監督檢驗研究院，烏魯木齊830011）

0 引言

牛磺酸是一種特殊的氨基酸，除了具有促進大腦及智力發育，保護視網膜的作用[1-4]，對肺、肝臟、胃腸等都有保護作用[5-6]。牛磺酸對嬰幼兒大腦發育、神經傳導、視覺機能的完善、鈣的吸收有良好作用，是一種對嬰兒生長發育重要的營養素[7]，國家標準中要求嬰幼兒配方乳粉中牛磺酸的添加量約為3 mg/100kJ[8-9]。

目前，檢測牛磺酸的方法主要為液相色譜的柱前衍生和柱后衍生兩類，柱后衍生需要的裝置較為昂貴，具有一定局限性。柱前衍生法有鄰苯二甲醛（OPA）衍生法[10-12]、單磺酰氯衍生法[13-14]、2，4-二硝基氟苯（DNFB）衍生法[15-16]以及9-氯甲酸芴甲酯(FMOC)衍生法[17]等。本研究選取了三種衍生試劑，利用柱前衍生法分別進行乳粉中牛磺酸的測定，同時進行方法比較，最終取得了滿意的結果。

1 實驗

1.1 主要儀器

waters 2695高效液相色譜儀，紫外檢測器，離心機，恒溫水浴鍋，超聲波儀。

1.2 試劑和材料

牛磺酸標準品sigma公司、單磺酰氯、9-氯甲酸芴甲酯(FMOC)、鄰苯二甲醛（OPA）、乙酸銨、甲醇、乙腈、乙硫醇為色譜純，亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、無水碳酸鈉、鹽酸、鹽酸甲胺、硼酸、氫氧化鈉為分析純。

配方乳粉，購于烏魯木齊某超市。

2 方法

2.1 樣品前處理

準確稱取樣品2.00 g，用40 mL溫水溶解并超聲10 min，加入蛋白沉淀劑各1 mL，用水定容至50 mL。試液于5000轉/分鐘下離心10 min，取上清液備用。

2.2 牛磺酸標準溶液的的配制

精確稱取0.025 g牛磺酸標準品，用蒸餾水溶解后定容至25 mL，配成質量濃度為1 g/L的標準儲備液，臨用前配制成質量濃度為0，5，10，20，40，100 mg/L的標準工作液。

2.3 單磺酰氯柱前衍生化法

2.3.1 主要試劑的配制

濃度為80 mmol/L碳酸鈉緩沖溶液：0.424 g無水碳酸鈉，加入40 mL水溶解，用濃度為1 mol/L鹽酸調pH值至9.5，用水定容50 mL。質量濃度為1.5 g/L單磺酰氯溶液：稱取0.15 g用乙腈定容100 mL，臨用前配制。質量濃度為20 g/L鹽酸甲胺溶液：稱取2 g用水定容100 mL，

2.3.2 衍生化方法

吸取2.1中的上清液1 mL到10 mL具塞玻璃管中，加入1 mL碳酸鈉緩沖液，1 mL丹磺酰氯溶液，充分混合，室溫避光衍生反應2 h（1 h后需搖晃1次），加入0.1 mL鹽酸甲胺溶液渦旋混合，以終止反應，避光靜置至沉淀完全。取上清液過濾，取濾液備用。同時取2.2中標準工作液1 mL與試液同步進行衍生。

2.3.3 色譜條件

色譜柱：Hypersil BDS C18柱（4.6 mm ×250 mm，5 μm）；流動相為甲醇∶濃度為0.02 mol/L乙酸銨緩沖溶液（pH=4）=60∶40（體積比），流速1 mL/min，柱溫為30℃，檢測波長（紫外檢測器）為254 nm。

2.4 FMOC柱前衍生化法

2.4.1 主要試劑的配制

0.3 mol/L硼酸鹽緩沖溶液：稱取1.85 g硼酸，用濃度為6 mol/L氫氧化鈉溶液調至pH值為8.0，用水定容至100 mL。質量濃度為1.5 g/L的FMOC溶液：稱取0.015 g的FMOC溶于10 mL乙腈中。

2.4.2 衍生化方法

吸取2.1中的上清液100 μL,加400 μL FMOC 溶液及400 μL硼酸鹽緩沖溶液，用乙腈定容至1 mL，超聲震蕩3 min，40度水浴反應10 min，上機測試。同時取2.2中標準工作液各100 μL與試液同步進行衍生。

2.4.3 色譜條件

色譜柱：Hypersil BDS C18柱（4.6 mm ×250 mm，5 μm）；流動相為甲醇∶濃度0.02 mol/L乙酸銨緩沖溶液（pH=4）=60∶40（體積比），流速1 mL/min，

柱溫為30℃，檢測波長為265 nm。

2.5 OPA柱前衍生化法

2.5.1 主要試劑的配制

濃度為0.4mol/L硼酸鈉緩沖溶液配制：稱取2.48 g硼酸和1.41 g氫氧化鈉，用水定容到100 mL；OPA衍生劑溶液：取0.05 g的OPA，用2 mL甲醇溶解，加入50 μ L乙硫醇，用濃度為0.4 mol/L硼酸鈉緩沖溶液定容至10 mL，4℃避光保存。

2.5.2 衍生化方法

用自動進樣器設定柱前衍生程序，吸取樣液10 μL再吸取10 μL衍生試劑混合，延時2 min后進樣。

2.5.3 色譜條件

色譜柱：Hypersil BDS C18柱（4.6 mm ×250 mm，5 μm）；流動相為甲醇∶濃度為0.02 mol/L的乙酸銨緩沖溶液（pH=4）=65∶35（體積比），流速1 mL/min，柱溫為30℃，檢測波長（紫外檢測器）為330 nm。

2.6 精密度與穩定性實驗

稱取3份配方乳粉，分別按照2.1，2.3，2.4和2.5的方法處理，并按上述色譜條件連續進樣6次，測定其峰面積，計算樣品中牛磺酸的質量濃度，得到三種不同衍生方法的6次測定結果的相對標準偏差。同時，將2.3.2與2.4.2的最終衍生樣品于4℃避光保存，每隔8 h進樣一次（10 μL），觀察測定時間對測定穩定性的影響。

2.7 回收率實驗

移取3份已知牛磺酸質量濃度的配方乳粉，分別加入0.25，1，2 mg牛磺酸標準工作液，根據2.1進行前處理，得到低、中、高3種濃度的牛磺酸混合液，再根據2.3.2，2.4.2與2.5.2的步驟進行衍生并進行測定分析。用外標法計算測定值，通過比較測定值與理論值，分別計算3種柱前衍生方法的回收率。

3 結果與分析

3.1 樣品前處理的方法選擇

因乳粉中含有大量的蛋白質及脂肪，若不在衍生化前除去，不僅會堵塞色譜柱，而且會影響色譜分離效果。沉降蛋白的方法一是使用蛋白沉淀劑，另一種就是使用有機溶劑如甲醇、乙腈等沉降蛋白。本研究稱取奶粉2 g溶解后加蛋白沉淀劑各1 mL，并定容至50 mL，處理樣品進行衍生化反應并經檢測，色譜峰峰型較好，干擾少。通過樣品的加標回收率可以看出，牛磺酸在前處理過程中損失較小。故本研究在處理配方乳粉時選擇蛋白沉淀劑沉降蛋白。

3.2 流動相緩沖溶液pH值的選擇

調節濃度為0.02 mol/L乙酸銨溶液的不同pH值作為緩沖溶液，分別與甲醇組成流動相。結果表面，在pH值在4.0時，牛磺酸衍生產物的峰形尖銳且無拖尾，故選擇流動相中緩沖溶液的pH值為4.0。圖1～圖3為三種不同柱前衍生方法所獲得的色譜圖。由圖1～圖3可以看出，三種衍生方法在此流動相條件下，均能夠得到較好的分離，且峰型對稱無拖尾。

3.3 線性關系及檢出限

按照2.3.3，2.4.3及2.5.3節條件下進行采集數據，分別以標準峰面積對標準工作溶液濃度進行線性回歸，得到牛磺酸標準品的線性回歸方程、相關系數、線性范圍以及檢出限，如表1所示。由表1可以看出，通過三種不同柱前衍生方法，牛磺酸在0～100 mg/L范圍內均具有良好的線性關系，相關系數均大于0.998，檢出限（S/N=3）最低為0.3 mg/L。

3.4 實驗方法的精密度與穩定性

按照2.6，分別得到三種柱前衍生方法的連續6次峰面積測定結果，其RSD分別為1.30%，0.84%，0.62%，表明精密度良好。單磺酰氯法和FMOC衍生化后的樣品在衍生后的0，8，16，24，36，48 h進樣，測定峰面積，RSD分別為1.09%和1.20%，表明單磺酰氯法和FMOC法衍生化后的樣品在4℃避光保存的條件下48 h內穩定。

3.5 回收率實驗

圖2 FMOC法衍生化色譜

由表2可以看出，三種柱前衍生法的高、中、低加標回收率以及相對標準偏差，OPA柱前衍生法的三個水平加標回收率雖然不是最高，但是其相對標準偏差均小于1%，主要是由于OPA柱前衍生法使用儀器編制程序進行衍生并測定，在樣品量和時間上都較其他兩種手工操作的方法更為精準，但是三種方法的回收率都達到94%以上，且各自的相對標準偏差均小于3%，說明三種柱前衍生法都能夠很好的測定樣品中牛磺酸的質量濃度。

圖3 OPA法衍生化色譜

表1 三種不同柱前衍生方法所得牛磺酸的線性方程、相關系數、線性范圍以及檢出限

4 結果與討論

（1）本研究選取了三種常用的衍生試劑單磺酰氯、FMOC、OPA，分別對配方乳粉中的牛磺酸進行柱前衍生并進行測定，良好的分離度以及回收率、穩定性等表明柱前衍生完全能夠達到配方乳粉中牛磺酸的檢測要求，相比需要昂貴柱后衍生裝置的柱后衍生法而言，柱前衍生法更為經濟適用，使用范圍更為廣泛。

（2）三種柱前衍生法，其中OPA衍生樣液對于衍生化時間要求比較嚴格，需在2 min內進樣測試，而相對于FMOC、單磺酰氯的衍生樣品，在4℃避光保存條件下48 h內穩定，測定時間范圍更為寬松。

（3）三種柱前衍生法的前處理都比較簡單，除了單磺酰氯衍生法需要2個小時的衍生時間，其余兩種方法的衍生化都非常快捷，尤其是OPA柱前衍生法，不僅快捷，而且簡單，只要利用自動進樣器進行程序設定，就能夠完成樣品衍生及測定，大大縮減了前處理過程并減小了人為操作的誤差。

表2 回收率測定結果

（4）本研究中三種柱前衍生測定配方乳粉中牛磺酸的方法不僅準確、快捷，而且經濟、實用，其檢出限最低為單磺酰氯衍生法的0.3 mg/L，相對于柱后衍生的1 mg/L[7]的檢出限而言，三種柱前衍生法在靈敏度上均高于柱后衍生法；同時，三種柱前衍生法的平均回收率也都高于柱后衍生法的平均回收率95.6%[7]。

綜上所述，柱前衍生法有著不可替代的優勢，完全能夠滿足配方乳粉中牛磺酸的檢測要求，檢測人員可以根據各自實驗室條件和實驗時間來選擇合適的柱前衍生化方法進行牛磺酸的檢測。

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