ACE抑制肽構效關系的研究進展及乳源性ACE抑制肽的加工利用現狀

沈小璐，吳蘭芳，2，郭善廣，范萌萌，程偉偉，蔣愛民

（1.華南農業大學食品學院，廣州510642；2.河北中醫學院，石家莊050200）

0 引言

近年來，生物活性肽已成為食品和醫藥領域的研究熱點。這類肽大多相對分子質量較小，在人體內消化吸收較蛋白質容易。不僅能提供人體生長發育所需要的營養，還能調節人體生理機能，起到預防、甚至治療疾病的作用[1]。目前發現的生物活性肽中所具有的功能包括降血壓、降脂、抗菌等。本文主要討論具有降壓效果的血管緊張素轉化酶（ACE）抑制肽[2]。

食物蛋白來源的ACE抑制肽通常由蛋白酶在溫和條件下水解蛋白質獲得，食用安全性高，對高血壓患者可以起到降壓作用而對血壓正常者無降壓作用，同時還具有免疫調節、減肥等功能，有著合成化學藥物不可比擬的優越性[3]。因此有必要對食物來源的ACE抑制肽進行深入的研究，以期更好的獲得和人工合成優良的ACE抑制肽。

1 ACE抑制肽的作用機制

1.1 ACE簡介

血管緊張素轉換酶(Angiotensin Convert Enzyme，ACE，EC 3.4.15.1)，是含Zn2+輔基的二肽羧肽酶，屬于二價金屬酶一族，需由Zn2+和Cl－激活，相對分子質量為120～150 ku。在哺乳動物中，這種鋅相關的金屬酶參與血壓的升降。ACE固定于細胞膜表面，可表現為兩種形式，一種是體細胞形式（成年人ACE由1277個氨基酸分子組成）存在于內皮、上皮和神經元細胞中，另一種是較小的雄性生殖細胞形式。ACE是多功能酶，存在于體內腎素-血管緊張素系統(renin-angiotension systemun，RAS）和激肽釋放酶-激肽系統(kallikrein-kinin system,KKS)中[4]。

1.2 ACE抑制肽的降壓機制

正常人體內的血壓受很多因素調節，其中最重要的調節系統是RAS和KKS，前者是升壓調節系統，后者是降壓調節系統，對血壓的調節起著重要的作用，調節過程如圖1所示。

圖1 ACE在血壓調節中的作用

ACE是RAS中起重要作用的酶，它通過作用于該系統的中血管緊張素Ⅰ，使其脫去C末端兩個氨基酸(His-Leu)而轉變成為血管緊張素Ⅱ，血管緊張素Ⅱ是RAS中已知活性最強的血管收縮劑，它能作用于小動脈，使血管平滑肌收縮，迅速引起升壓效應；同時還能刺激醛固酮分泌和直接對腸胃作用(減少腎血流量及促進Na+、K+的重吸收)，引起鈉貯量和血容量的增加，也能使血壓升高。另一方面，ACE也能作用于KKS降血壓系統中的緩激肽，緩激肽是降血壓物質，ACE催化從緩激肽C末端脫去兩個氨基酸殘基而使其失活，從而削弱緩激肽的降血壓作用。如果抑制了ACE的活性，就能有效的防治高血壓的發生。降血壓肽能競爭性地抑制ACE的活性，從而阻斷RAS的升血壓作用，同時增強KKS的降壓作用，起到降低高血壓患者血壓的作用[4]。

2 ACE抑制肽的來源

自1965年Ferreira首次從南美洲蝮蛇(Bothropsjararaca)的毒液中發現血管緊張素轉化酶抑制劑后，蛇毒中存在降血壓肽的研究引起了人們極大的興趣。因而，毒蛇中ACE抑制肽的發現具有重大醫療價值，人們已在體內證實了毒蛇中ACE抑制肽能通過控制ACE活性達到預防與治療腎依賴型高血壓的效果[5]。

從食物來源上來看，ACE抑制肽主要來源于乳蛋白，動、植物蛋白和發酵食品。大豆、乳品和水產品是公認的優質蛋白源，且資源豐富，可作為提取ACE抑制肽原料，目前采用最多的是從牛奶蛋白中提取ACE抑制肽[3]。

3 ACE抑制肽的結構鑒定及構效關系

3.1 ACE抑制肽的活性與分子大小有密切關系

通常認為，肽分子量越小，其ACE抑制活性越高。代永剛等[6]人經過超濾分離，制備的ACE抑制肽活性及IC50都有顯著提高。小于4 ku超濾液的ACE抑制活性比4～10 ku超濾液提高了13.22%，比原酶解液提高了17.63%。半抑制濃度比原酶解液提高了42.08%。Segura－Campos等[7]用豇豆分離蛋白酶解獲得ACE抑制肽，然后用4種截留分子量的超濾膜進行超濾，并將ACE抑制活性最高的多肽段進行凝膠過濾和RP－HPLC純化，結果表明相對分子質量＜1 ku的多肽段具有最高的ACE抑制活性。Ryan等[8]在研究肽氨基酸序列結構特點的時也可以看出大部分小分子的肽ACE抑制活性普遍高于大分子多肽。Fu-Yuan CHENG等[9]人在研究雞骨蛋白時也表明有水解物表現出的強的ACE抑制活性與那些小肽有關。但是，它們的關系也并非絕對，例如，二肽Try－Lys的分子量為300 u，其 IC50為1.63 μmol/L，而11 肽Met－Ile－Phe－Pro－Gly－Ala－Gly－Gly－Pro－Glu－Leu 分子量為1.3 ku，其 IC50為28.7 μg/mL，兩者均具有較強的ACE抑制活性[2]。

3.2 ACE抑制肽的活性與氨基酸序列結構

目前，對于ACE抑制肽的構效關系還沒有完全研究透，但是很多的研究結果已有報到。國內外學者普遍認為，ACE抑制肽活性與其自身特性有關。體細胞ACE（somaticACE，sACE）的C端催化部位包括三個子催化位點見圖2：S’、S1’和S2’，這三個位點分別與血管緊張素ⅠC-末端的三個疏水性殘基Phe-His-Leu相對應。

圖2 ACE結構

研究發現C端氨基酸與ACE抑制肽的抑制活性有重要關系，C端為芳香族氨基酸和脯氨酸時其抑制活性較高[3]。

Ryan[8]等研究發現在倒數第二的位置，脂肪族（V，I，A），堿性（R）和芳香族（Y和F）氨基酸殘基是首選，而芳香族（W，Y和F）、脯氨酸（P）和脂肪族（A，L和M）殘基在肽C-末端的最終位置出現頻率較多。而且，C端殘基上帶正電荷的氨基酸，如賴氨酸（ε-氨基）和精氨酸（胍基），可以顯著提高降壓肽的抑制活性。賈俊強等[10]通過收集270種降壓肽的氨基酸組成進行分析，結果疏水氨基酸和非疏水氨基酸在降血壓肽的N端出現的頻率相比僅多了6.6%，說明疏水氨基酸并不是降血壓肽的N端必須要有的氨基酸,而是隨機出現在降血壓肽的N端。與降血壓肽的N端氨基酸特征相比，其C端氨基酸特征對降血壓活性影響更為重要。Cheung等[11]研究也認為ACE抑制肽的活性主要取決于C－端氨基酸，C－端氨基酸為芳香族氨基酸(包括色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸)和脯氨酸時其抑制活性較高。

此外，段秀等[3]表明對于大于3個氨基酸長度的多肽，羥脯氨酸（Hyp）的存在是肽與ACE催化位點結合的關鍵。而且，肽的整體疏水性很重要，親水性肽具有弱的或沒有ACE抑制活性，因為親水性肽與ACE的活性部位是不相容的。事實上，ACE抑制作用是通過疏水性多肽與ACE子催化位點的高親和力來實現的。ACE抑制肽的作用不僅僅與C端三個氨基酸殘基有關，切割位點的N端殘基可能與ACE的關鍵子催化點相互作用。

3.3 ACE抑制肽的活性與氨基酸之間的構象

短肽的生物活性除了與一級結構氨基酸數量、種類和序列有關系之外，也與其構象存在關系，但目前對于ACE抑制肽高級結構與活性的關系研究尚不深入。

王強等[12]在花生ACE抑制肽的研究中采用固相合成方法合成了具有相同氨基酸序列的短肽，并對合成肽活性進行測定。實驗證實此種氨基酸序列的短肽具有明顯的體外ACE抑制活性，且合成短肽的活性高于花生蛋白源短肽KLYMRP。得出原因可能是ACE抑制肽各氨基酸之間可形成多種不同構象，肽鏈的空間構象與其功能活性也存在一定的相關性[13]。他們通過量子化學理論對ACE抑制肽的活性部位進行了推測，初步探討了其ACE抑制活性與構象的關系。通過短肽Lys-Leu-Tyr-Met-Arg-Pro(KLYMRP)的構象優化、短肽KLYMRP與ACE之間的相互作用分析表明，短肽KLYMRP與ACE活性位點的殘基形成5個氫鍵，一個Pi-Cation相互作用，并與鋅離子形成配位鍵，這些作用力共同穩定了短肽-ACE復合物的構象，從而有利于ACE抑制活性的發揮。

4 ACE抑制肽的定量構效關系（QSAR）

目前國內外ACE抑制肽的研究多集中于肽的制備、純化、序列測定、體內/外活性評價等方面，對ACE抑制肽的構效關系研究也有一定進展，但大多是一些定性描述。一般認為ACE抑制肽C末端結構對其競爭性結合于ACE上有著重要的影響，更傾向于C末端三肽的每個位置含有疏水性氨基酸。隨著不同結構的ACE抑制肽不斷從食物蛋白水解液中分離出來，學者們發現有許多活性極強的肽并不滿足上述規律。因此，如何準確表征ACE抑制肽的結構，預測肽的活性，闡明其作用機理，并在此基礎上進一步開發ACE抑制肽類藥物已成為目前亟待解決的問題[14]。

定量構效關系(Quantitative Structure Activity Relationship，QSAR)作為一種定量描述活性物質結構與活性關系的有效手段，具有量效關系明確、信息豐富、對未知化合物活性預測能力強等優點。計算機輔助分子設計的方法為功能食品的開發和創新提供了一種新的手段[15]。由于ACE抑制肽是一類相對分子質量較小的短肽(一般低于1500)，對其結構的定量描述不會過于復雜，因此具有可行性。對ACE抑制肽進行QSAR研究將有助于深入理解肽的結構特征以及活性機理。

劉靜等[16]收集20種天然氨基酸的457種理化性質，按照疏水、電性特征、氫鍵貢獻和立體特征分類后，對它們分別進行主成分分析(Principal component analysis,PCA)，得到一個新的氨基酸殘基結構描述符SVHEHS。采用PLS算法進行ACE抑制肽的QSAR建模研究，最后擬合出投影重要性指標圖、主成分的得分分布散點圖、肽到模型X空間中心規格化距離圖、載荷貢獻散點圖、肽的實驗值和預測值關系圖等對樣本肽進行結構描述。此描述符能用于ACE抑制肽的活性預測和分子設計，有利于ACE抑制肽的深入研究。

蘇淅娜等[14]采用氨基酸描述符SVHEHS(Scores Vector of Hydrophobic，Electronic，Hydrogen bonds and Steric Properties)對各肽樣本進行結構表征后，進行自交叉協方差(Auto Cross Covariances，ACC)處理，并分別利用多元線性回歸(Multiple linearregression，MLR)[15]、偏最小二乘(Partial least square regression，PLS)、人工神經網絡(Artificial neural networks，ANN)3種建模方法進行ACE抑制肽QSAR建模。結果發現：ANN與PLS模型的R2分別為0.958、0.862，Q2Loo分別為 0.948、0.829，Q2ext分別為 0.634、0.632，即ANN模型在擬合能力以及模型穩健性方面更好，但其外部預測能力與PLS模型相差不大；而MLR模型的 R2、Q2Loo、Q2ext均較小，建模效果相對較差[14]。最終模型能對不同長度、活性差異大的肽進行準確的活性預測。

5 乳源性ACE抑制肽的加工利用

高血壓是我國主要的常見疾病之一，且呈數量逐漸上升、人群年輕化的趨勢，ACE抑制劑藥物在治療高血壓的過程中得到了公眾的認可，但由于其對腎臟的毒副作用及對其他的一些副作用迫使人們尋找更加安全高效的ACE抑制劑，而從天然食物中分離到的ACE抑制肽正好符合這一特點[17]。

高血壓的治療應從預防開始，ACE抑制肽可作為保健食品平時服用。現階段，大部分的ACE抑制肽來自天然動植物蛋白，提取方法多采用酶解，較為安全，這類食品人們的接受程度也較高。目前，日本是研究降壓肽最為深入的國家，酸奶飲品中添加降血壓肽作為保健飲品已在日本上市，形成了較為成熟的產業鏈[2]。

5.1 加工利用

乳及乳制品含有最豐富的動物蛋白質。研究表明，其不僅能給人提供豐富的營養，而且還是許多生物活性肽的重要來源，其中最具有開發和應用價值的是ACE抑制肽。自Maruyama等[18]于1982年從酪蛋白水解物中分離出具有ACE抑制活性的12肽(CEJ12)以來，各國研究人員采用不同的方法陸續從酪蛋白中分離提取出了更多的ACE抑制肽。乳及乳制品來源的抗高血壓活性肽成為乳品研究領域的新熱點，現已在乳酪蛋白、乳清蛋白、發酵乳等[19-22]中發現了許多抗高血壓活性肽。HARTMANN R等[23]的研究總結也說明了目前國外以乳源蛋白為原料的降血壓產品越來越多。

1995年，Nakamura等人[24,25]用Lactobacillus helveti-cus和Saccharomyces cerevisiae作為發酵劑制作了一種名為Calpis的酸乳飲料。實驗得出，隨著發酵時間的增長，牛奶的ACE抑制活性增加；SHR長期服用Calpis后，可抑制血壓上升。王世賓等[26]通過對Evolus高鈣發酵乳（采用特殊菌種－瑞士乳桿菌發酵，）的研究表明：經嚴格科學的工藝控制，得到高含量的降血壓短肽，可以起到降低血壓的作用。Evolus高鈣發酵乳與其他某些產品其降血壓優越性更強，并且自身對人體收縮和舒張壓有明顯的降壓效果。除此之外，BLANCA H L等人[27-29]也研究制備了一些乳源降壓肽降壓產品并且驗證了它們在臨床上的效果。

5.2 展望

通過對ACE抑制肽不斷深入的研究，更有利于掌握ACE抑制肽的結構功能的關系，從而更好的為有效提取，更重要的為是人工合成服務。

我國有著豐富動植物蛋白資源，而且食品加工產生下腳料也可作為其原料來源[7]。乳源性ACE抑制肽的應用只是其中的一小部分，如何合理利用好現有的資源加工制備高活性ACE抑制肽將是今后的主要研究方向之一。ACE抑制肽的研究目前還處于起步階段，所以有著巨大的潛在市場和廣闊的發展前景。

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