耐酸植物乳桿菌的紫外誘變選育及性質的研究

尹義敏，田豐偉，翟齊嘯，王剛，張秋香，張灝，陳衛，2

（1.江南大學食品學院，江蘇無錫214122；2.江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇無錫214122）

0 引言

乳酸菌是能夠利用糖類發酵產乳酸的一類無芽孢、革蘭氏陽性細菌的總稱，包括乳桿菌、乳球菌和雙歧桿菌等至少23個屬[1]。廣泛應用于醫藥、食品和飼料等行業中，被公認為是安全的食品級微生物[2]。乳酸菌能維持腸道平衡[3]、降低血清膽固醇[4-6]、增強免疫能力[7]等。

乳酸菌發酵不斷積累的乳酸，以及胃酸環境嚴重影響其生理活性。因此，耐酸性被認為是益生乳酸菌篩選過程中重要的因素之一[8]。近年來，適應性進化和定向進化被廣泛應用于極端微生物的篩選，并且成功選育一些耐極端環境的微生物，但周期相對較長[9-12]。所以，傳統的誘變育種篩選菌株仍是不錯的選擇。

本實驗對Lactobacillus planturam CCFM8661進行紫外誘變，通過低pH MRS培養基篩選出兩株耐酸能力提高且性能較穩定的誘變菌株。

1 實驗

1.1 菌株與培養基

實驗所用菌株為植物乳桿菌（Lactobacillus planta?rum CCFM8661），為江南大學食品學院生物技術中心實驗室自行分離。在MRS培養基中培養，培養條件為37℃(24 h)。篩選培養基為pH值為3.5和3.0的MRS培養基（用濃度為1 mol/L的HCl調節）。

1.2 方法

1.2.1 實驗流程

菌種活化→初始菌株生長曲線的測定→菌懸液的制備→紫外誘變處理→耐酸突變株的初篩→耐酸突變株的復篩→突變株耐酸能力的分析→遺傳穩定性的測定

1.2.2 生長曲線的測定

將活化的菌株以2%的接種量接種到MRS液體培養基中，37℃培養，每隔2 h取樣測定

OD600值，以空白MRS培養基為對照。以時間為橫坐標，OD600值為縱坐標，繪制初始菌株的生長曲線。

1.3 菌懸液的制備

將活化初始菌株以2%接種量接種到MRS液體培養基中，37℃恒溫培養至對數生長期中后期。取出10 mL菌液，在6 000 r/min下離心10 min，棄掉上清液，收集菌體。然后用濃度為0.1 mol/L pH值為7.0磷酸緩沖液（PBS）洗滌3次，主要是將殘留的培養基洗凈。將細胞重新懸浮在PBS緩沖液中，將細胞濃度調節到108mL-l，制成菌懸液。最后加入玻璃株振蕩分散10 min，用無菌脫脂棉過濾，使形成單細胞，分散程度達90%～95%。

1.4 紫外誘變處理

取制備好的菌懸液5 mL于直徑9 cm的無菌平皿中，在其中加入轉子。紫外燈打開預熱30 min，以穩定光波。將盛有菌懸液的平皿放置磁力攪拌器上，放到離功率為15W的紫外燈30 cm處，開啟磁力攪拌器，打開平皿蓋，暴露紫外光下照射一定時間，邊攪拌邊照射，力求使細胞均勻吸收紫外線光波。使用秒表計時，分別照射15，30，45，60，75，90 s。以上照射過程是在有紅光的暗室內進行，以免光修復。

1.5 菌株致死率的測定

分別取經過UV照射處理的菌液與未照射處理的（作為空白對照）菌懸液1 mL進行梯度稀釋。取0.1 mL稀釋液在MRS固體培養基上涂勻，將平板用黑布包好，倒置于37℃恒溫培養箱中培養24 h，待平板上長出菌落進行計數計算致死率[13]。實驗三次平行，取平均值。

致死率為

致死率=（A-B）/A×100%，

式中：A為未經照射處理菌體長出的菌落數；B為紫外照射處理菌體長出的菌落數。

1.6 耐酸突變株的篩選

挑選形狀規則的誘變后單菌落移至MRS液體培養基上，并置于37℃，培養24 h。再以2%接種量分別接種于含200 μL pH3.5 MRS培養基的96孔板中，繼續培養24 h后，使用酶標儀測得OD600，計算相對生長率。將初篩得到相對生長率明顯高于出發菌株的菌體挑選出來，以2%接種量轉接到含200 μL pH3.0 MRS培養基的96孔板中，37℃下培養24 h，用酶標儀測得OD600，計算相對生長率[14]，即相對生長率=（d-b-c）/（a-b-c）× 100%，

式中：a為測定的菌株在pH=6.3的培養基中生長的吸光值；b為測得的空白培養基的吸光值；c為計算得接種時的吸光值（10%接種量×菌株活化后的吸光值）；d為測定的菌株在pH=3.5培養基中生長的吸光值。

1.7 遺傳穩定性分析

將上述實驗得到的突變株在MRS液體培養基中連續傳代10次，將每一代都接種到pH值為3.0的MRS液體培養基中，37℃培養24 h。取每次傳代菌株的菌液測定其OD600，計算相對生長率。每代重復三次，觀察其遺傳穩定性。

1.8 突變株的耐酸性能分析

為了比較突變株與原始菌株在pH值為3.5條件下的生長情況，將正突變株與出發菌株分別接種到pH值為3.5的MRS液體培養基中，37℃下培養24 h。然后梯度稀釋，測定活菌數。

將突變株與原始菌株接種到pH值為3.0的MRS液體培養基中，脅迫不同時間，梯度稀釋涂在MRS平板上測定活菌數和存活率來比較分析存活能力。

2 結果與分析

2.1 L.plantarum CCFM8661的生長曲線

為了保證誘變處理時細胞具有一定的濃度從而可以增加細胞變異數，選擇對數生長中后期的細胞進行誘變處理。生長曲線如圖1所示。

由圖1可以看出，L.plantarum CCFM8661的對數期在4～14 h，之后菌液濃度基本保持不變，因此選用12 h的菌體制備菌懸液進行紫外誘變處理。

圖1 L.plantarum CCFM8661的生長曲線

2.2 紫外誘變劑量的確定

用于微生物誘變的紫外線劑量的表示方法，可分絕對劑量和相對劑量。絕對劑量需要用一種劑量儀來測定，由于操作困難，不常被采用。常采用紫外線的致死率來表示相對劑量。

根據文獻報道[12]，一般認為誘變后菌體的致死率在90%～95%效果較好，更容易篩選出變異幅度較大的突變菌株。因此本文以此為依據確定最佳誘變劑量。

以照射時間為橫坐標，致死率（%）為縱坐標繪制L.plantarum CCFM8661的致死率曲線，如圖2所示。

圖2 L.plantarum CCFM8661的致死率曲線

由圖2可以看出，隨著紫外線照射時間的延長，致死率逐漸上升。當照射15 s時，致死率為65.27%。當照射30 s時，致死率達到90.30%，之后致死率趨于平緩。按照菌體致死率大約在90%～95%之間的誘變劑量來觀察其正突變率。因此，本研究采取照射時間為30 s，致死率為90.30%。

2.3 耐酸突變株的篩選

對L.plantarum CCFM8661紫外誘變30 s，從誘變后的突變菌株中挑取107個菌落進行篩選，分別編號為V-1到V-107，在pH3.5的MRS液體培養基中初篩得到13株相對生長率明顯高于原始菌株，然后在pH3.0的MRS液體培養基進行復篩。13株菌的相對生長率具體數據結果如表1所示。表1中數據為三組平行的平均值。

表1 菌株在不同pH值的培養基中的相對生長率

由表1可以看出，經過初步篩選，有13株突變菌株在pH值為3.5的MRS液體培養基中相對生長率明顯高于原始菌株；經過pH值為3.0的培養基進行復篩，其相對生長率提高幅度不大，僅有兩株突變株相對生長率大于6%。其中，V-30在pH值為3.5的相對生長率由39.83%提高到49.67%，V-48相對生長率由39.83%提高到51.18%；V-30在pH值為3.0的相對生長率由3.30%提高到7.30%，V-48相對生長率由3.30%提高到6.96%。所以由此可判斷V-30與V-48較原始菌株更能耐受pH值為3.5與pH值為3.0的酸環境。即V-30與V-48作為下面實驗研究的目標突變株。

2.4 突變株遺傳穩定性的分析

L.plantarumCCFM8661的突變菌株V-30和V-48遺傳穩定性的測定結果如圖3所示。

由圖3可以得出，在pH值為3.0的條件下突變株V-30和V-48每傳一代的相對生長率都比較穩定，沒有出現原位回復突變的情況，由此可以說明誘變菌株的遺傳穩定性較好。

2.5 突變株的耐酸能力比較分析

為了分析突變菌株的耐酸性質，將原始菌株與突變株在pH值為3.5條件培養測定活菌數，在pH值為3.0條件下分別培養2，4和6 h測定存活率，結果如圖4所示。圖4中，V-30與V-48的活菌數明顯高于原始菌株，分別是原始菌株的2.06和2.46倍。不同字母代表的組別間具有顯著性差異（P＜0.05）。

圖3 遺傳穩定性測定結果

圖4 突變菌株在pH3.5的MRS液體培養基中的生長能力

由圖4可以看出，在pH值為3.5的MRS中培養24 h后，V-30與V-48的活菌數明顯高于原始菌株，分別是原始菌株的2.06和2.46倍。

圖5 突變株在pH=3.0 MRS培養基中的存活率

圖5為突變菌株V-30、V-48和原始菌株L.plan?tarumCCFM8661對鹽酸脅迫的耐受性。由圖4可以看出，隨著鹽酸脅迫時間的延長，原始菌株與突變菌株的存活率都存在不同程度的下降，當脅迫6 h后，原始菌株存活率為44%，而突變株V-30存活率為74.58%，V-48存活率為76.74%，分別提高了30.58%和32.74%。

3 討論

乳酸菌作為益生菌，發揮其益生作用必須達到一定的活菌數。然而，外部的酸脅迫環境與人體內胃酸溶液都嚴重地影響了它的生理特性。因此，提高乳酸菌的酸耐受性是非常有必要的。而紫外誘變作為一種傳統的誘變育種方法，條件簡單、易于操作，在篩選耐極端環境的乳酸菌也有成功的報道。

本研究選擇L.plantarum CCFM8661作為出發菌株，通過紫外誘變的方法來提高耐酸能力。結果表明，經過紫外誘變得到的兩株突變株V-30與V-48在pH值為3.5和3.0的相對生長率均有所提高，且在pH值為3.0條件下存活能力也明顯增強。表明紫外誘變對植物乳桿菌提高耐酸性是有效果的，為進一步研究耐酸機制奠定了基礎。

[1]任大勇，李昌，秦艷青，等.乳酸菌益生功能及作用機制研究進展[J].中國獸藥雜志，2011，45(2)：47-50.

[2]WASSENAAR T M,KLEIN G.Safety Aspects and Implications of Regulation of Probiotic Bacteria in Food and Food Supplements[J].J Food Prol,2008,71(8):1734-1741.

[3]尹勝利，杜鑒，徐晨.乳酸菌的研究現狀及其應用[J].生物工程，2012，37(9)：25-29.

[4]AVAREZRC OLMOS M,OBERHELMAN R.Probiotic agents and infectious diseases:a modernPerspective on a traditional therapy[J].Clinical Infectious Diseases,2001,32:1567-1576.

[5]張美鈴，周志華，趙立平.糞便中大腸桿菌多態性分子研究[J].微生物學通報，2005,，32(2)：5-9.

[6]王立平，徐杰，云月英，等.蒙古國傳統發酵酸馬奶中乳桿菌潛在益生特性的研究[J].中國乳品工業，2005，33(4)：4-10.

[7]MATTILA-SANDHOLM T,MYLLARINEN P.CRITTENDEN R,et al.Technological challenges for futureProbiotic foods[J].International dairy journal,2002,12(2/3):173-182.

[8]PARVEZ S,MALIK K A,KANG S A,et al.Probiotics and their fermented food products are beneficialFor health[J].J Appl Microbiol,2006,100:1171-1185.

[9]WANG Y,LI Y,PEI X,et al.Genome-shuffling improved acid tolerance and l-lactic acid volumetric productivity in Lactobacillus rhamnosus[J].J Biotechnol,2007,129(3):510-515.

[10]SHI D J,WANG C L,WANG K M.Genome shuffling to improve thermotolerance,ethanol tolerance and ethanol productivity of Saccharomyces cerevisiae[J].J Ind Microbiol Biot,2009,36(1):139-147.

[11]PORTNOY V A,BEZDAN D,ZENGLER K.Adaptive laboratory evolution-harnessing the power of biology for metabolic engineering[J].Curr Opin Biotech,2011,22(4):590-594.

[12]ZHANG J,WU C,DU G,et al.Enhanced acid tolerance in Lactobacillus casei by adaptive evolution and compared stress response during acid stress[J].Biotechnol Bioproc Eng,2012,17(2):283-289.

[13]呂紅線，林建群，林建強.L-乳酸高產菌株的誘變選育[J].中國釀造，2008，185(8):8-10.

[14]諸葛健.工業微生物實驗技術手冊[M].北京：中國輕工出版社，1994.