MiR-15a對奶牛乳腺上皮細(xì)胞泌乳功能的影響

邵麗，曲波，王春梅，李慶章，高學(xué)軍，李慧銘，王褚悅，張莉

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150030）

0 引言

MicroRNAs（miRNAs）是近年來發(fā)現(xiàn)的一類廣泛存在于動植物細(xì)胞的內(nèi)源性單鏈非編碼RNA分子，它在調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄與表達(dá)、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、機(jī)體生長發(fā)育等過程中發(fā)揮著重要的作用[1]。miRNAs可通過部分互補(bǔ)結(jié)合到靶基因mRNA的非編碼區(qū)3′UTR從而阻礙其翻譯來調(diào)控基因的表達(dá)[2]。miR-15a定位于人類染色體13q14[3]，其作為凋亡因子、癌基因、抑癌基因、抑制細(xì)胞周期蛋白表達(dá)等方面的作用都有相關(guān)的研究報道[4-7]。Li等[8]研究發(fā)現(xiàn)miR-15a可通過調(diào)控生長激素受體，影響奶牛乳腺上皮細(xì)胞泌乳通路蛋白的表達(dá)?？傊壳瓣P(guān)于miR-15a對奶牛乳腺上皮細(xì)胞具體作用的研究還是很少。本實(shí)驗(yàn)通過在奶牛乳腺細(xì)胞中過表達(dá)bta-miR-15a，研究其對奶牛乳腺上皮細(xì)胞泌乳功能的具體影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動物組織

本研究選取妊娠中期奶牛乳腺組織用于乳腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)，器具嚴(yán)格滅菌。準(zhǔn)備含有100 U/mL青霉素和質(zhì)量濃度為100 mg/L鏈霉素的經(jīng)0.22 μm濾膜過濾D-Hank’s緩沖液。常規(guī)手術(shù)切取乳腺組織，迅速將乳腺組織切割成塊約100 ng的小組織塊，生理鹽水沖洗幾次后，將組織置于裝有D-Hank’s緩沖液（含雙抗、兩性霉素）的三角瓶中，冰盒保存，馬上帶回實(shí)驗(yàn)，用于乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 抗體與試劑

Cytokeratin（C-04）18 Antibody，鼠抗羊β-actin多克隆抗體，辣根酶標(biāo)記山羊抗兔，山羊抗鼠IgG一抗，F(xiàn)ITC-山羊抗兔IgG，山羊抗鼠二抗；bta-miR-15a mimics，Negative Control，轉(zhuǎn)染試劑 LipofectamineTM2000，DMEM/F-12培養(yǎng)基，胎牛血清，DMSO，Opti-MEM I medium（Gibco），β-Casein 抗體，BCA蛋白濃度測定試劑盒，預(yù)染蛋白Marker（10～230ku）；PX型醫(yī)用X-ray膠片，ECL超敏發(fā)光液，血液甘油三酯酶測定試劑盒，Lactose/D-Glucose Assay Kit試劑盒等。

1.1.3 主要儀器和設(shè)備

倒置相差顯微鏡DFC280，激光掃描共聚焦顯微鏡 TCS-SP2 AOBS，Mini Trans-Blot Criterion半干轉(zhuǎn)印儀，Model 680型全自動酶標(biāo)儀，DYY-5型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀，DYCZ-23A型穩(wěn)壓電泳槽，PowerLook 2100XL掃描儀，ULT1386-3-V30型超低溫冰箱，超純水器，立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器，CO-150 CO2培養(yǎng)箱等。

1.2 方法

1.2.1 奶牛乳腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定

按Ke等[9-11]的方法進(jìn)行奶牛乳腺上皮細(xì)胞的分離和原代培養(yǎng)。將所得的奶牛乳腺上皮細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，在37℃質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)上皮細(xì)胞與成纖維細(xì)胞對酶敏感性不同將混合生長的原代或傳代奶牛乳腺上皮細(xì)胞純化。將純化的奶牛乳腺上皮細(xì)胞接種到35 mm小皿中，質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛固定，質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的BSA封閉，細(xì)胞角蛋白18一抗，F(xiàn)ITC-山羊抗兔IgG二抗免疫熒光染色，在激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞角蛋白18的特異性表達(dá)情況，參考文獻(xiàn)[12]中的方法進(jìn)行。

1.2.2 奶牛乳腺上皮細(xì)胞的瞬時轉(zhuǎn)染

取對數(shù)生長期的奶牛乳腺上皮細(xì)胞，用完全培養(yǎng)基將其濃度調(diào)整為6.0×105mL-1，接種于六孔培養(yǎng)板中，37℃培養(yǎng)箱中孵育過夜待轉(zhuǎn)染。用①Opti-MEM I medium稀釋LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑（6孔培養(yǎng)板6 μL+94 μL），輕輕混勻，在室溫孵育5 min；②將 miR-15a mimics、Negative Control分別用適量Opti-MEM I medium稀釋（6孔細(xì)胞培養(yǎng)板8 μL+92 μL），柔和混勻室溫孵育5 min。①＋②分別混勻，每組實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)，形成的復(fù)合物在室溫條件下孵育20 min，將復(fù)合物逐滴加入換有Opti-MEM I medium培養(yǎng)基的待轉(zhuǎn)染細(xì)胞中；輕輕晃動細(xì)胞培養(yǎng)板以使細(xì)胞與復(fù)合物充分接觸混合均勻，在37℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，6 h后更換完全培養(yǎng)基，48 h后收集樣品，備用。

實(shí)驗(yàn)具體分組如下：bta-miR-15a過表達(dá)組（bta-miR-15a mimics）；miR-15a陰性對照組（microRNA mimics NC）；加LipofectamineTM2000的空白對照組。

1.2.3 細(xì)胞分泌乳糖質(zhì)量濃度的檢測

轉(zhuǎn)染方法和分組同1.2.2，每組3個平行，轉(zhuǎn)染48 h后，收集6組細(xì)胞培養(yǎng)液，檢測方法按照Lactose/D-Glucose(Rapid)Assay Kit試劑盒（Megazyme）說明書進(jìn)行。在同等條件下進(jìn)行乳糖含量的測定。

1.2.4 細(xì)胞分泌甘油三酯濃度的檢測

轉(zhuǎn)染方法和分組同1.2.2，每組3個平行，48 h后收集6組細(xì)胞培養(yǎng)液，檢測方法按照血液甘油三酯酶法測定試劑盒（北京普利萊基因技術(shù)有限公司）說明書進(jìn)行。

1.2.5 細(xì)胞β-酪蛋白表達(dá)量的檢測

轉(zhuǎn)染方法同1.2.2，分6組，每組3個平行，轉(zhuǎn)染48h后，分別收獲各組奶牛乳腺上皮細(xì)胞，用細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白，收集的細(xì)胞裂解液放入超聲儀中震蕩3次，每次10 s；再放入100℃水中煮沸5～10 min，12 000 r/min離心5 min，Manodrop2000測定蛋白濃度，2×SDS上樣緩沖液調(diào)成相同濃度分裝到200 μL小EP管中，置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩＿M(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳并轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)印后的NC膜37℃封閉2 h，一抗過夜，二抗1 h。在暗室中，加入ECL超敏化學(xué)發(fā)光液孵育壓暗盒曝光，顯影，定影。采用Image J2x軟件對Western blotting圖譜進(jìn)行灰度掃描分析。

一抗為兔抗人β-Casein抗體、鼠抗羊β-actin多克隆抗體；二抗為辣根酶標(biāo)記羊抗兔、羊抗鼠IgG，以β-actin為內(nèi)參，進(jìn)行光密度分析。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS16.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析。本實(shí)驗(yàn)所有試驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)兩組之間比較采用t檢驗(yàn)分析，三組數(shù)據(jù)比較則采用單因素方差分析，P＜0.05有統(tǒng)計學(xué)意義，定量數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果

2.1 奶牛乳腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定

圖1為奶牛乳腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)與純化。圖1中，在倒置相差顯微鏡下觀察純化的奶牛乳腺上皮細(xì)胞，細(xì)胞排列緊密、形態(tài)均一，呈鵝卵石狀（圖1A）；圖1B為成纖維細(xì)胞；圖1C為乳腺上皮細(xì)胞與成纖維混合生長。圖2為免疫熒光鑒定奶牛乳腺上皮細(xì)胞角蛋白18。圖2中，圓形的是DAPI染色的細(xì)胞核，絲狀綠色的是角蛋白18。由圖2可以看出，本研究純化后的細(xì)胞是奶牛乳腺上皮細(xì)胞。

圖1 奶牛乳腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)與純化

圖2 奶牛乳腺上皮細(xì)胞的角蛋白18鑒定

2.2 細(xì)胞分泌乳糖質(zhì)量濃度的影響

過表達(dá)miR-15a，轉(zhuǎn)染48h后分別收集培養(yǎng)液，應(yīng)用Lactose/D-Glucose(Rapid)Assay Kit試劑盒檢驗(yàn)細(xì)胞培養(yǎng)液中的乳糖質(zhì)量濃度。檢測結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計分析后如表1所示。由表1可以看出，兩個對照組之間乳糖的分泌量沒有顯著差異（P＞0.05），而在miR-15a基因過表達(dá)組中，奶牛乳腺上皮細(xì)胞所分泌的乳糖質(zhì)量濃度要顯著低于陰性對照組和空白對照組（P＜0.05），表明miR-15a可抑制奶牛乳腺上皮細(xì)胞乳糖的產(chǎn)生和分泌。

表1 奶牛乳腺上皮細(xì)胞中乳糖質(zhì)量濃度的檢測結(jié)果

2.3 細(xì)胞分泌甘油三酯濃度的變化

過表達(dá)miR-15a，轉(zhuǎn)染48 h后分別收集培養(yǎng)液，應(yīng)用甘油三脂測定試劑盒檢測奶牛乳腺上皮細(xì)胞中的甘油三酯濃度，結(jié)果如表2所示。根據(jù)甘油三酯標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖3）分析比較試驗(yàn)結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-15a后，奶牛乳腺上皮細(xì)胞中的甘油三酯濃度顯著減少（P＜0.05），表明miR-15a可抑制奶牛乳腺上皮細(xì)胞甘油三酯的產(chǎn)生和分泌。

圖3 甘油三酯標(biāo)準(zhǔn)曲線

表2 奶牛乳腺上皮細(xì)胞中甘油三酯濃度的檢測結(jié)果

2.4 細(xì)胞β-酪蛋白表達(dá)量的影響

用miR-15a mimics和negative control分別轉(zhuǎn)染奶牛乳腺上皮細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后，應(yīng)用Western blotting方法檢測奶牛乳腺上皮細(xì)胞β-酪蛋白的表達(dá)變化。圖4（a）為miR-15a超表達(dá)后Western blotting方法檢測β-酪蛋白含量的結(jié)果；圖4（b）為灰度掃描分析酪蛋白表達(dá)的光密度分析結(jié)果，通過3個平行實(shí)驗(yàn)獲得試驗(yàn)數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示與對照組相比，miR-15a mimics轉(zhuǎn)染48 h后，奶牛乳腺上皮細(xì)胞中β-酪蛋白的表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）。圖4中，1為miR-15a過表達(dá)組；2為陰性對照組；3為空白對照組

圖4 miR-15a過表達(dá)后奶牛乳腺上皮細(xì)胞β-酪蛋白的檢測結(jié)果

3 討論

乳腺是合成乳蛋白的重要器官。乳蛋白的組成成分和含量是衡量牛奶營養(yǎng)品質(zhì)的重要指標(biāo)，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)高低不僅決定牛奶的風(fēng)味水平，而且是乳制品企業(yè)的核心競爭力[13]。乳汁中最主要的營養(yǎng)物質(zhì)是乳糖、蛋白質(zhì)和甘油三脂。β-酪蛋白（CSN2）是牛乳中含量最高的乳蛋白，也是乳蛋白中含量最高的酪蛋白，β-酪蛋白代表乳腺上皮細(xì)胞分泌乳蛋白的多少[14]。在泌乳激素的刺激下，β-酪蛋白具有很強(qiáng)的表達(dá)活性，其調(diào)控成分能夠指導(dǎo)靶基因在乳腺組織中高效表達(dá)[15]。所以本研究選擇乳糖、甘油三脂和β-酪蛋白進(jìn)行miR-15a對泌乳功能影響的研究指標(biāo)。角蛋白18是奶牛乳腺上皮細(xì)胞的識別蛋白，在奶牛乳腺上皮細(xì)胞的鑒定中普遍應(yīng)用[16-18]，所以本試驗(yàn)選擇該方法進(jìn)行奶牛乳腺上皮細(xì)胞的鑒定。

目前發(fā)現(xiàn)的miRNA作用于靶基因mRNA的具體機(jī)制有兩種，一種是當(dāng)miRNA序列與靶基因mRNA的3′UTRs堿基區(qū)域近乎完全配對互補(bǔ)結(jié)合時則進(jìn)行剪切作用，促使靶基因的mRNA迅速地降解而抑制基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)；當(dāng)miRNA與靶基因mRNA不完全互補(bǔ)配對結(jié)合時，則會抑制靶基因mRNA的翻譯而發(fā)揮其調(diào)節(jié)功能，但是卻不會造成靶基因mRNA的降解[19]。另外一種情況是miRNAs誘導(dǎo)其靶基因mRNA快速地脫腺苷酸化，造成靶基因mRNA的快速衰弱和表達(dá)量的降低而發(fā)揮作用[20-22]。乳腺的發(fā)育可歷經(jīng)胚胎期、青春期、妊娠期、泌乳期、退化期等一系列時期，同時也是雌性哺乳動物出生之后能夠多次重復(fù)生長發(fā)育的唯一的器官。所以miRNAs作為基因轉(zhuǎn)錄后表達(dá)調(diào)節(jié)的小分子，如何調(diào)控乳腺的發(fā)育、泌乳、退化以及相關(guān)基因的表達(dá)研究具有重要的理論和實(shí)際意義。2009年，Tanaka等研究報道了miR-101a在小鼠乳腺中通過調(diào)節(jié)環(huán)氧酶-2的表達(dá)進(jìn)而調(diào)節(jié)乳腺的發(fā)育[23]。2013年，Xu等研究發(fā)現(xiàn)在乳腺癌發(fā)生過程中，miR-148a/152-DNMT1信號通路可能起到重要的調(diào)節(jié)作用[24]。在小鼠的乳腺中，miR-126-3p特異性的參與了乳腺的發(fā)育過程，并且靶向調(diào)節(jié)孕酮受體，抑制小鼠乳腺上皮細(xì)胞的增殖以及-酪蛋白的分泌[25]。本實(shí)驗(yàn)室的王杰等人研究發(fā)現(xiàn)miR-152調(diào)控p-Stat5、p-mTOR、Cyclin D1蛋白表達(dá)，能促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞增殖和乳蛋白合成[26]。目前國內(nèi)外的研究中，miR-15a對奶牛乳腺發(fā)育及其泌乳功能的調(diào)控報道很少。本實(shí)驗(yàn)室從2012年開始關(guān)注miR-15a，發(fā)現(xiàn)其可以通過調(diào)節(jié)奶牛乳腺上皮細(xì)胞中生長激素受體起作用[8]。本研究通過在奶牛乳腺上皮細(xì)胞中過表達(dá)miR-15a，研究其對奶牛乳腺泌乳功能的影響，主要檢測其對乳糖、甘油三酯、酪蛋白泌乳指標(biāo)的影響，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-15a降低了奶牛乳腺上皮細(xì)胞的細(xì)胞活力，降低了乳糖和甘油三脂的分泌以及β-酪蛋白的表達(dá)，表明bta-miR-15a負(fù)調(diào)控奶牛乳腺細(xì)胞的泌乳功能，說明其極可能與退化期奶牛乳腺上皮細(xì)胞的凋亡作用有關(guān)。

4 結(jié)論

本研究證明bta-miR-15a可抑制奶牛乳腺上皮細(xì)胞乳糖、甘油三酯和β-酪蛋白的分泌表達(dá)，降低奶牛乳腺上皮細(xì)胞的細(xì)胞活力，表明bta-miR-15a負(fù)調(diào)控奶牛乳腺上皮細(xì)胞的泌乳功能。這為進(jìn)一步研究miR-15a在奶牛乳腺發(fā)育及泌乳功能方面的作用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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