明綠豆苯丙氨酸解氨酶的分離純化及性質(zhì)初步研究

張 瑜 李梅青，2 代蕾莉 蔡 娟 付志偉

（安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院1，合肥 230036）

（合肥農(nóng)產(chǎn)品加工研究院2，合肥 230036）

明綠豆苯丙氨酸解氨酶的分離純化及性質(zhì)初步研究

張 瑜1李梅青1，2代蕾莉1蔡 娟1付志偉1

（安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院1，合肥 230036）

（合肥農(nóng)產(chǎn)品加工研究院2，合肥 230036）

為了研究明綠豆中苯丙氨酸解氨酶（PAL）的動力學(xué)特性，采用35%和65%飽和度的硫酸銨分級沉淀、DE－52陰離子交換層析方法對明綠豆中的PAL進(jìn)行了分離純化，并對其基本性質(zhì)做了初步研究。結(jié)果表明，PAL的純化倍數(shù)為6.982 9，蛋白質(zhì)得率為4.65%，酶得率為32.45%。PAL在硼砂－硼酸緩沖溶液中適宜的pH范圍為7.6～9.0，最適pH有2個(gè)：8.0和8.6。PAL適宜的溫度范圍為35～45℃，最適反應(yīng)溫度為40℃。得到 PAL的 2個(gè) Km值，分別是：Km1為6.94×10－5mol／L，Km2為 1.23×10－4mol／L。本研究結(jié)果可為進(jìn)一步研究和開發(fā)明綠豆的PAL提供參考。

明綠豆 苯丙氨酸解氨酶 分離純化 基本性質(zhì)

綠豆（Mung bean）為豆科草本植物綠豆（Phaseolus radiatus）的成熟種子［1］。《本草綱目》中提及：“綠豆，消腫治痘之功雖同于赤豆，而壓熱解毒之力過之”，并可“解金石、砒霜、草木一切諸毒”。可見古人認(rèn)識到綠豆具有清熱解暑、止渴利尿、消腫止癢、解毒等藥用功效［2－3］。

苯丙氨酸解氨酶（L－phenylalanine ammonialyase，PAL；EC4.3.1.5）能催化L－苯丙氨酸生成反式肉桂酸進(jìn)入苯丙烷代謝途徑，為多種酚類、生物堿及類黃酮等終產(chǎn)物提供前體物質(zhì)，是連接初級代謝和苯丙烷類代謝、催化苯丙烷類代謝第一步反應(yīng)的關(guān)鍵酶和限制酶［4－5］。Abell等［6］依據(jù) PAL特異的催化反應(yīng)將其用于抗腫瘤和治療苯丙酮尿癥的研究中，并取得了肯定的結(jié)果。PAL主要存在于高等植物（如：銀杏葉［7］、山藥［8］、石斛［9］、綠豆［10］等）、部分微生物（絲狀真菌、酵母及鏈霉菌）和某些藻類中。國內(nèi)有研究證明，從綠豆中提取的PAL對小鼠淋巴白細(xì)胞白血病細(xì)胞株（L1210）的抑制作用隨作用時(shí)間的延長和藥物劑量的增加而增強(qiáng)［10］。然而，綠豆中PAL純化及基本性質(zhì)的研究鮮見報(bào)道。

明光綠豆以其色澤晶瑩碧綠，粒大皮薄、湯清易爛，清香可口等特點(diǎn)，質(zhì)量為全國之冠，被稱為“明綠”，曾經(jīng)被作為貢品。2008年，“明光綠豆”獲得國家原產(chǎn)地保護(hù)標(biāo)志，然而，對其功能性成分分析研究極少。

本研究采用鹽析方法分離明綠豆中的PAL，采用離子層析法對其進(jìn)一步純化，并對其性質(zhì)進(jìn)行初步研究，系統(tǒng)了解明綠豆PAL的反應(yīng)動力學(xué)特性，為明綠豆功能性成分的高效利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

明綠豆：安徽燕之坊食品有限公司；β－巰基乙醇、EDTA、L－苯丙氨酸、牛血清蛋白均為分析純。高速冷凍離心機(jī)（LR16－A）：北京雷勃爾離心機(jī)有限公司；DE－52：Whatman分裝。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 酶活性及蛋白質(zhì)的測定

1.2.1.1 酶活性測定及活性單位的定義

采用Koukol等［11］的方法，略加修改。吸取0.5mL 0.06mol／L的L－苯丙氨酸和9.45mL硼酸－硼砂緩沖溶液（pH 8.7，20 mmol／Lβ－巰基乙醇，1 mmol／L的EDTA），加入0.05mL的酶液。同時(shí)調(diào)零管取0.5mL 0.06mol／L的L－苯丙氨酸，加9.5mL的硼酸－硼砂緩沖溶液；對照管加入9.95mL的硼酸－硼砂緩沖溶液和0.05mL的酶液。40℃水浴反應(yīng)1 h，滴加6mol／L的 HCl 0.2mL終止反應(yīng)，于290 nm處比色。以每小時(shí)每毫升酶液光密度值增加0.01為一個(gè)酶活單位（U）。所有測定均重復(fù)3次。

1.2.1.2 蛋白質(zhì)含量的測定

參照Bradford等［12］方法以牛血清蛋白做標(biāo)準(zhǔn)曲線得到回歸方程：y＝0．492 8x＋0．026 5。

1.2.2 明綠豆PAL粗酶液的制備及分離純化

1.2.2.1 PAL粗酶液的提取

取明綠豆80 g，加入預(yù)冷的硼酸－硼砂緩沖溶液160mL，于4℃的冰箱浸泡24 h。搗碎，勻漿，4℃下12 000 r／min離心20min，上清液即為粗酶液，取粗酶液4℃下保存以供純化。

1.2.2.2 硫酸銨分級沉淀及脫鹽濃縮

將固體硫酸銨粉末加入粗酶液至35%飽和度，磁力攪拌30min，4℃靜置4 h。4℃下12 000 r／min離心20min，取上清液加固體硫酸銨粉末到65%飽和度，然后依據(jù)上述方法，4℃下12 000 r／min離心20min，棄上清液。將沉淀復(fù)溶于70mL 0.05mol／L的Tris－HCl（pH＝8.8）緩沖溶液中。將復(fù)溶后的酶液裝入已經(jīng)處理好的透析袋中，4℃下用0.05mol／L的Tris－HCl緩沖溶液中脫鹽10 h，然后再用聚乙二醇濃縮1 h。

1.2.2.3 PAL粗酶液的純化

將濃縮后的酶液過DE－52層析柱（Φ2.6 cm×30 cm，已用 pH為8.8的0.05mol／L Tris－HCl緩沖溶液平衡），以0～0.8mol／L的 NaCl Tris－HCl（pH 8.8）緩沖溶液梯度洗脫，每5min 1管，每管10mL。合并有酶活的部分，然后經(jīng)透析、超濾濃縮、冷凍干燥得純酶。

1.2.3 PAL酶學(xué)性質(zhì)

1.2.3.1 明綠豆PAL最適pH、溫度、酶濃度、底物濃度的測定

根據(jù)酶活性測定的反應(yīng)體系，以0.06mol／L的L－苯丙氨酸為底物，在pH值為7.6～9.2的硼酸－硼砂緩沖溶液反應(yīng)體系中設(shè)定一系列pH梯度，測定各梯度pH的酶活力，確定PAL的最適pH；在25～80℃溫度范圍內(nèi)，設(shè)置一系列的溫度梯度，測定各溫度梯度下PAL的酶活力，確定最適反應(yīng)溫度；分別取PAL酶液0.1～1.7mL，設(shè)置一定酶濃度梯度的反應(yīng)體系，并測定各酶濃度梯度下PAL的酶活，確定最適酶濃度。在L－苯丙氨酸的終物質(zhì)的量濃度為0.5～9 mmol／L內(nèi)，設(shè)置一系列底物濃度的反應(yīng)體系，并測定各體系中PAL的活力，確定最適底物濃度。

1.2.3.2 明綠豆PAL動力學(xué)曲線

取0.05mL的酶液和0.5mL的0.06mol／L的L－苯丙氨酸溶液，加pH 8.7硼酸－硼砂緩沖溶液定容至10mL，于40℃水浴。5～360min內(nèi)設(shè)置一系列的時(shí)間梯度，并測定各時(shí)間梯度PAL的酶活力。

1.2.3.3 明綠豆PAL的Km值

在9.45mL pH 8.7硼酸－硼砂緩沖溶液中加入0.05mL酶液，再分別加入0.5mL物質(zhì)的量濃度0.001～0.01mol／L的L－苯丙氨酸溶液，測定各濃度對應(yīng)的PAL酶活力。將各底物濃度的酶活力對反應(yīng)時(shí)間作圖，求出酶促反應(yīng)速度V。分別求出1／［V］及1／［S］，按照 Lineweaver－Burk雙倒數(shù)法作圖，求出PAL的Km值。

2 結(jié)果與分析

2.1 明綠豆PAL的分離純化

明綠豆PAL粗酶液經(jīng)硫酸銨分級沉淀、脫鹽濃縮以及DE－52層析，分離純化結(jié)果見表1，洗脫結(jié)果見圖1。

表1 明綠豆PAL的分離純化結(jié)果

圖1 明綠豆PAL纖維素DE－52層析結(jié)果

由表1可知，明綠豆PAL的純化倍數(shù)為6.982 9，蛋白質(zhì)得率為4.65%，酶得率為32.45%。由圖1可知有2個(gè)活力峰，從而推測PAL有2種同工酶。

2.2 明綠豆PAL最適pH、溫度、酶濃度、底物濃度

由圖2可以看出，在不同pH的硼酸－硼砂緩沖溶液中酶活力出現(xiàn)2個(gè)峰值，即2個(gè)最適pH值：8.0和8.6，這可能與明綠豆體內(nèi)含有PAL的同工酶有關(guān)［13］。明綠豆PAL在 pH 7.6～9.0時(shí)酶活力都在其最大活力的50%以上，因此該酶在pH 7.6～9.0之間比較穩(wěn)定。PAL維持活性的最適pH范圍為8.0～9.5。

圖2 酶的最適pH

由圖3可知，明綠豆PAL在25～40℃時(shí)，酶活性隨著溫度的升高而上升。當(dāng)溫度處于35～40℃范圍時(shí)，酶活力較高，為最適溫度范圍，40℃時(shí)明綠豆PAL活力最高，45℃以后酶活性受到抑制。當(dāng)溫度接近80℃時(shí)PAL的活力已基本喪失。此結(jié)果與其他材料中的PAL研究結(jié)果基本一致［14－18］。

圖3 酶的最適溫度

如圖4所示，明綠豆PAL的最適底物物質(zhì)的量濃度為1.5 mmol／L，此時(shí)酶活力達(dá)到最大值，而當(dāng)?shù)孜镂镔|(zhì)的量濃度達(dá)到5 mmol／L時(shí)，酶活性到達(dá)第二個(gè)峰值。然后隨底物濃度的增大，酶活力減少。當(dāng)?shù)孜镂镔|(zhì)的量濃度增大到7 mmol／L時(shí)，酶活力逐漸保持穩(wěn)定。

圖4 底物濃度對酶活力的影響

由圖5可知，在酶量較低，即酶量小于0.13mL時(shí)，隨著酶量的增加，其吸光值增加較明顯。當(dāng)加酶量高于0.13mL時(shí)，吸光值的增加緩慢。這可能是因?yàn)榇藭r(shí)底物相對于酶是過量的，而高濃度的底物會抑制底物，增加酶的濃度能解除這種抑制，從而增加酶的含量，提高酶的反應(yīng)速率。當(dāng)酶濃度較高而底物濃度不足時(shí)將產(chǎn)生限制因子，反應(yīng)速度與酶濃度之間不再保持線性關(guān)系，或者是酶作用產(chǎn)物的增加對酶產(chǎn)生抑制作用，從而導(dǎo)致反應(yīng)速度增長量的下降［9］。

圖5 酶量對酶活力的影響

2.3 明綠豆PAL的動力學(xué)曲線

PAL催化L－苯丙氨酸反應(yīng)生成反式肉桂酸，在反應(yīng)開始的3 h內(nèi)，反應(yīng)產(chǎn)物與反應(yīng)時(shí)間基本成線性關(guān)系（圖6），但是反應(yīng)在80min內(nèi)的速率比80～180min內(nèi)的反應(yīng)速率高。PAL在反應(yīng)3 h之后，反應(yīng)進(jìn)程曲線逐漸變平。這是因?yàn)楸奖彼嶂饾u減少，反式肉桂酸的生成量逐漸積累，對酶的反饋抑制作用加強(qiáng)，所以反應(yīng)速度逐漸下降［8］。

圖6 PAL的反應(yīng)進(jìn)程曲線

2.4 明綠豆PAL的Km

用Lineweaver－Burk雙倒數(shù)法作圖，結(jié)果如圖7所示。Km即為直線在X負(fù)軸上截距的負(fù)倒數(shù)。由圖7可知明綠豆PAL有2個(gè)Km值，通過計(jì)算可得：Km1為 6.94×10－5mol／L，Km2為 1.23×10－4mol／L，這與0.3×10－4～1.5×10－2mol／L之間的結(jié)果相一致［5］。

圖7 PAL雙倒數(shù)作圖

3 討論

試驗(yàn)結(jié)果的蛋白質(zhì)得率偏低，這或許與本試驗(yàn)在進(jìn)行粗酶分離時(shí)所采用的硫酸銨的飽和度、離子強(qiáng)度以及緩沖溶液的pH沒有經(jīng)過優(yōu)化有關(guān)。離子洗脫時(shí)PAL得率偏低，主要是因?yàn)镻AL存在同工酶［13］，經(jīng)硫酸銨分級沉淀及DE－52柱后去除了部分同工酶，純化出單一酶的過程可能造成部分損失所致。

對PAL性質(zhì)的前期研究發(fā)現(xiàn)：銀杏葉中PAL的2個(gè)最適pH 8.0和8.8［19］、山藥中PAL的2個(gè)最適pH 8.0和 8.8［8］、霍山石斛中 PAL的最適 pH 8.4［9］，無殼葫蘆籽中的最適pH 8.5［14］，這表明不同植物來源的PAL的最適pH存在差異。

本研究中底物濃度對PAL活力的影響曲線圖呈S型，這與其他原材料 PAL研究結(jié)果類似，如銀杏［19］、石斛［9］、山藥［8］及蘆筍［20］等，這可能與不同來源PAL普遍存在同工酶有關(guān)。同時(shí)有報(bào)道稱，如果PAL存在別構(gòu)酶，也會導(dǎo)致這種情況的出現(xiàn)［21］。對此，還需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

明綠豆PAL的純化倍數(shù)為6.982 9，蛋白質(zhì)得率為4.65%，酶得率為32.45%。PAL適宜的pH范圍為7.6～9.0，最適pH值分別為8.0和8.6。適宜的溫度范圍為35～45℃，最適反應(yīng)溫度為40℃，45℃以后酶活性受到抑制。當(dāng)溫度接近80℃時(shí)PAL的活力已基本喪失。

明綠豆PAL的最適底物物質(zhì)的量濃度為1.5 mmol／L。當(dāng)?shù)孜镂镔|(zhì)的量濃度增大到7 mmol／L時(shí)，酶活力逐漸保持穩(wěn)定。

明綠豆PAL催化L－苯丙氨酸反應(yīng)生成反式肉桂酸，在反應(yīng)的開始3 h內(nèi)，反應(yīng)產(chǎn)物與反應(yīng)時(shí)間基本成線性關(guān)系。反應(yīng)3 h之后，反應(yīng)進(jìn)程曲線逐漸變平。所以在測定PAL的活性時(shí)，反應(yīng)時(shí)間選擇3 h之內(nèi)為基準(zhǔn)，以1 h的反應(yīng)產(chǎn)物量表示酶的活力。

Lineweaver－Burk雙倒數(shù)法作圖，得到明綠豆PAL的2個(gè) Km值，分別是：Km1為6.94×10－5mol／L，Km2為 1.23×10－4mol／L。

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Purification and Properties of Phenylalanine Ammonia－Lyase in Ming Mung Bean

Zhang Yu1Li Meiqing1，2Dai Leili1Cai Juan1Fu Zhiwei1

（Anhui Agricultural University School of Tea and Food Science＆Technology1，Hefei 230036）
（Institute of Hefei Agricultural Products Processing2，Hefei 230036）

The study in this paper aimed to research the dynamics characteristics of phenylalanine ammonialyase（PAL）from Mingmung bean.The isolation，purification and basic properties of L－phenylalanine ammonialyase in Mingmung bean were studied by 35%and 65%saturation of ammonium sulfate grade deposition，DE－52 anion exchange chromatography.The results showed that the purification multiple was 6.982 9 and protein yield and PAL yield were 4.65%and 32.45%respectively.The optimal pH range of PAL in borax－boric acid buffer was 7.6～9.0 and there were two optimal pH as 8.0 and 8.6.The optimal temperature range of PAL was 35～45℃.The optimal temperaturewas40℃.Therewere two Kmvalues including 6.94×10－5mol／L and 1.23×10－4mol／L.The results provided the reference for further studying and developing PAL of Mingmung bean.

mingmung bean，L－phenylalanine ammonia－lyase，isolation and purification，basic properties

Q946.5

A

1003－0174（2015）06－0101－05

合肥農(nóng)產(chǎn)品加工研究院資助院企合作項(xiàng)目（2012HAP P002）

2014－01－22

張瑜，女，1988年出生，碩士，植物源食品開發(fā)與利用

李梅青，女，1965年出生，副教授，農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏