高效液相色譜-示差折光法測定飼料中大豆低聚糖含量

潘 城， 歐陽立群， 林 欽， 黃永輝， 劉 芳， 梁 敏

（福建省產品質量檢驗研究院，福建福州350002）

大豆低聚糖又稱大豆寡糖，是大豆中可溶性寡糖的總稱，主要成分是水蘇糖、棉籽糖和蔗糖等，其中具有獨特生理功能的成分是棉籽糖和水蘇糖（張振紅等，2005）。目前，大豆低聚糖的測定方法包括離子色譜法、薄層色譜法、氣相色譜法、高效液相色譜法 （馬朝陽等，2012；廖春龍等，2010；吳朝陽等，2010）。離子色譜法靈敏度較好，但是在電極表面糖類會發生氧化還原反應，從而影響方法的準確性；薄層色譜法測定易產生假陽性且定量誤差較大，耗時較長；氣相色譜法檢測糖類需要進行衍生化處理，操作費時且繁瑣。高效液相色譜法作為常用的檢測方法，其蒸發光檢測器和示差折光檢測器均可以用于大豆低聚糖的檢測，但蒸發光檢測器在各大企業實驗室還未完全普及，示差折光檢測器是檢測糖類物質的標準配置，易于普及應用。本實驗采用氨基鍵合相色譜柱與示差檢測器聯用技術，建立了簡單、快速、準確的飼料中大豆低聚糖分離檢測技術。該方法的建立可為飼料產品中大豆低聚糖的生產、應用和監管提供有效的技術支撐。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑 Waters 2695高效液相色譜儀配 2414示差檢測器 （美國 Waters公司）、DS-8510超聲波發生器 （上海生析超聲儀器有限公司）、Milli Q超純水制備器 （美國Milipor公司）。乙腈為色譜純（山東禹王實業有限公司），其他試劑為分析純。大豆低聚糖標準品：蔗糖 （純度≥99%），購于德國Dr公司；棉籽糖（純度≥98%），購于上海源葉生物科技有限公司；水蘇糖（純度≥98%），購于德國CNW公司。

1.2 標準儲備液和工作溶液配制 大豆低聚糖標準儲備液的配制：準確稱取蔗糖、棉籽糖和水蘇糖標準品5 g，用50%乙醇溶液溶解并定容至100 mL，配制成濃度為50 mg/mL的標準儲備液。

標準工作溶液的配制：將大豆低聚糖的標準儲備液采用逐級稀釋的方法配制濃度從0.5～10 mg/mL系列標準工作溶液，所有標準儲備液和標準工作溶液均置于冰箱中0～4℃溫度下保存。

1.3 樣品前處理 稱取飼料樣品1 g于100 mL的燒杯中，加入25 mL 50%乙醇溶液，于超聲波振蕩器中超聲萃取20 min后，轉移至50 mL容量瓶中，50%乙醇溶液定容至刻度，混勻，取上清液，以0.45 μm濾膜過濾，濾液供分析用。

1.4 色譜條件 色譜柱：XB-NH2柱 （250 mm×4.6 mm，5 μm，美國 Welch 公司）；柱溫：35 ℃；流動相：乙腈∶水=65∶35；流速 1.0 mL/min；進樣量 20 μL。

1.5 計算方法 用外標法分別測定蔗糖、棉籽糖和水蘇糖的含量，上述三種組分糖含量的總和為樣品中大豆低聚糖的含量。

2 結果與討論

2.1 色譜條件優化 不同糖分子在氨基柱中形成了不同強度的氫鍵結合力，在分離時具有一定的優勢。因此本方法選用氨基柱作為分離色譜柱，同時選擇乙腈-水為流動相。實驗對比了不同乙腈-水比例對三種大豆低聚糖保留時間的影響，結果表明，采用乙腈∶水=65∶35進行等度洗脫可得到較好的分離效果。大豆低聚糖不具有紫外或熒光吸收基團，因此無法采用紫外或熒光檢測器進行檢測。本方法通過優化色譜條件，選用示差折光檢測器可得到較好的靈敏度。大豆低聚糖標準溶液色譜圖、飼料樣品色譜圖和飼料樣品加標色譜圖分別見圖1～圖3。

圖1 大豆低聚糖標準溶液色譜

圖2 樣品色譜

圖3 樣品加標色譜

2.2 前處理條件優化 糖類具有較好的水溶性，實驗結合超聲波振蕩器可充分萃取樣品中的大豆低聚糖。提取液中的蛋白質等化合物會對測定樣品中的大豆低聚糖產生干擾。乙醇具有沉淀蛋白的作用，可以降低其他化合物對檢測準確性的影響。但糖類物質在較高濃度的乙醇溶液中不容易溶解。本實驗以80%乙醇溶液和50%乙醇溶液作為提取液，并進行了比較，8%的乙醇溶液進行提取時，回收率為60%～73%。50%乙醇溶液可以很好地溶解大豆低聚糖，加標提取率在90%以上，同時對飼料蛋白有較好的沉淀作用。因此本實驗選用50%乙醇溶液進行提取。

2.3 線性關系和檢出限及定量限 配制大豆低聚糖各濃度系列標準工作溶液，以大豆低聚糖的峰面積對濃度進行線性回歸。由表1可見，蔗糖、棉籽糖和水蘇糖在0.5～10 mg/mL具有很好的線性關系，蔗糖和水蘇糖相關系數R均為1.0000，棉籽糖的相關系數R為0.9999。以3倍信噪比（S/N=3）為檢出限，以10倍信噪比（S/N=10）為定量限。

表1 方法檢出限與定量限

2.4 回收率和精密度 在優化后的測試條件下，取飼料樣品進行三水平加標回收率測試，每個水平重復分析6次，結果見表2。從表2可知，各組分的加標回收率為90.6%～106%，相對標準偏差RSD為1.6%～4.2%，結果表明，該方法的準確度較高，可用于飼料中大豆低聚糖的日常分析檢測。

表2 大豆低聚糖加標回收率實驗結果（n=6）%

3 結論

本實驗采用超聲萃取法結合高效液相色譜-示差折光檢測器，有效地分離了蔗糖、棉籽糖和水蘇糖，建立了飼料中大豆低聚糖含量的測定方法。該方法操作簡單，準確可靠，靈敏度較高，適用于飼料樣品中大豆低聚糖含量的日常檢測分析。

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