特異性結合革蘭氏陰性菌外膜蛋白C的單鏈抗體核糖體展示文庫的構建

王 瀟 ， 王秀敏 ， 管慶豐 ， 滕 達 ， 姚軍虎 ， 王建華 *

（1.西北農林科技大學動物科技學院，陜西楊凌 712100；2.農業部飼料生物技術重點實驗室，北京海淀100081；3.中國農業科學院飼料研究所基因工程研究室，北京海淀 100081）

多種革蘭氏陰性菌如大腸桿菌、志賀氏菌及沙門氏菌等均為飼料中常見病原菌，會引發腹瀉、敗血癥等疾病（周曉清，2012）。常規抗菌劑或者抗菌藥多具廣譜抗菌性，對正常菌群也有很強抑制效果，無差別性殺菌容易破壞腸道微生態環境，使機體遭受二次感染（Mao等，2012）。而靶向抗菌劑能選擇性殺滅目標菌，對正常細菌無作用或作用較?。ɑ酐惗潞土杈鶙?，2009）。特異性靶向定位區對靶向抗菌劑的靶向效應具有結構決定作用。單鏈抗體可變區片段 （scFv）是輕鏈 （VL）和重鏈（VH）可變區通過（Gly4Ser）3 linker連接而成的具有抗原親和力的抗體片段，是靶向抗菌劑特異性靶向定位區的理想候選物之一（Pan等，2012；Ahmad 等，2012）。

外膜蛋白C（OmpC）在多種革蘭氏陰性菌膜上均有分布，具有運輸疏水性分子等生理機能，為耐藥性關聯蛋白，且能引發機體強烈的體液免疫反應并產生特異性抗體 （Liu等，2012a、b）。 核糖體展示技術是將抗體庫體外轉錄翻譯并在完成后阻止mRNA及蛋白脫落，形成蛋白質、核糖體與mRNA分子聚合物，進而實現親和篩選獲得與靶抗原具有高親和性的單鏈抗體序列的過程（Plückthun，2012）。 近年來核糖體展示技術由于克服了基因庫的轉化丟失及胞內難以表達毒性蛋白的限制，作為一種篩選容量大、多樣性好的方式，已成功用于抗體、酶及其他蛋白的篩選（Sun等，2012）。在核糖體展示中，構建高質量、大容量scFv庫是保證篩選出高親和力抗體可變區序列的關鍵。scFv具有分子量小、組織穿透力強，且含有決定抗體與抗原特異性的結構，在抗原物質檢測和藥物設計方面具有極高的參考價值。本課題組前期工作已完成大腸桿菌OmpC的原核重組表達（待發表），本研究將其作為抗原蛋白開展了相關工作，PCR構建核糖體展示抗體庫，篩得抗OmpC蛋白的特異性scFv，旨在為構建飼料有害革蘭氏陰性菌的預警檢測及靶向抗菌劑和關聯藥物的靶向定位區設計提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 純化的重組大腸桿菌外膜蛋白OmpC（C端帶有6×His標簽）由本實驗室制備；Taq DNA聚合酶、EasyPfu高保真DNA聚合酶、DNA marker，均購自全式金生物科技有限公司；TRIZOL、逆轉錄PCR試劑盒，均購自TaKaRa公司；PCR產物純化和膠回收試劑盒，均購自天根生化科技有限公司。引物由上海生工公司合成；DNA測序服務由上海生工公司提供。6～8周齡雌性BALB／c小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 大腸桿菌外膜蛋白OmpC免疫小鼠和骨髓細胞制備 將OmpC蛋白 （純度為96%）免疫3只6～8周齡雌性BALB／c小鼠。初次免疫佐劑為完全弗氏佐劑，皮下注射；初次免疫3周后進行二免，佐劑為不完全弗氏佐劑，腹腔注射；2周后進行三免，免疫方式同二免。蛋白免疫劑量為25 μg/只[（25 μg 蛋白溶于 25 μL 磷酸鹽緩沖液（PBS），加入25 μL免疫佐劑及50 μL PBS，移液器吹打乳化后 100 μL/只免疫）]。

免疫后6 d，脫頸處死小鼠。將小鼠脛骨和股骨上的肌肉和脂肪去除，并用外科手術剪減掉兩端，用20 mL PBS沖洗，收集于50 mL離心管中。收集的骨髓組織用70 μm濾膜過濾，離心10 min（4 ℃，335 g），棄上清，將沉淀重懸于 3 mL 紅細胞裂解液中，25℃輕柔搖動5 min。向細胞重懸液中加入 20 mL PBS，4℃、335 g離心 10 min， 棄上清，將沉淀重懸于1 mL PBS中。將上一步得到的重懸液于4℃、930 g離心5 min，獲得小鼠骨髓細胞。

1.2.2 OmpC免疫小鼠骨髓細胞總RNA的提取及其cDNA逆轉錄 按TRIZOL法提取細胞總RNA（朱姜，2008）。按照 TaKaRa RNA PCR Kit說明書，利用隨機引物Oligo（dT）l5將小鼠骨髓細胞總RNA逆轉錄為cDNA（孟夏萌，2008）。

1.2.3 元件、引物的設計與合成 元件合成見表1：（1）含有T7啟動子、5'端莖環結構與核糖體結合位點序列（Shine Dalgarno，SD）的 scFv 上游元件序列。 （2）含有6His myc標簽、gⅢ tether和 3'端莖環結構的scFv下游元件序列。

表1 構建核糖體展示文庫合成元件

引物設計見表2：（1）用于擴增抗體庫VL和VH 的 引 物 ：VHF、VHR、VLF 和VLR （Luo 和 Xia，2012）。 （2）用于擴增帶有（Gly4Ser）3 linker的 VH和VL序列的引物：VH+linker R和VL+linker F。重鏈下游引物及輕鏈上游引物均帶有linker序列，以便通過重疊延伸PCR合成帶有linker序列的scFv基因。（3）用于在VL基因下游連接帶有6His標簽的堿基序列，便于鑒定和純化的引物：HisRev VLR。（4）重疊延伸獲得連接gⅢ tether及最終序列的引物：T7B和T6te。

1.2.4 構建核糖體展示文庫 核糖體展示元件構建示意如圖1所示：（1）以反轉錄產物cDNA為模板，以 VHF、VHR，VLF、VLR 為引物分別進行 PCR 擴增 VH、VL 基因；（2）將引物 VHF、VH+linker R，VLF、VL+linker F分別混合，以VH、VL基因為模板，PCR獲得VH+linker序列和VL+linker序列，用膠回收試劑盒純化；（3）將等物質的量濃度的純化產物VH+linker和VL+linker混合，利用引物VHF和VLR進行重疊延伸PCR，將VH與VL通過linker連接獲得scFv基因庫，用膠回收試劑盒純化；（4）以引物VHF和HisRev VLR對scFv基因進行PCR擴增，獲得帶6His標簽的scFv序列，用膠回收試劑盒純化；（5）將等物質的量濃度的純化產物scFv（帶有6His標簽）與gⅢ tether混合，利用引物VHF和T6te進行重疊延伸PCR，獲得連接gⅢtether及3'端莖環結構序列；（6）純化所獲序列與T7SD序列等物質的量濃度混合，利用引物T7B和T6te進行重疊延伸PCR反應，最后獲得完整序列（圖1）。

表2 構建核糖體展示文庫引物序列

圖1 核糖體展示元件的構建過程

2 結果與分析

2.1 PCR法獲得抗體庫VH、VL及其連接linker序列 本課題組前期研究表明，大腸桿菌OmpC蛋白免疫BALB/c小鼠后所產生抗體對OmpC蛋白的效價高達1∶240000，對大腸桿菌菌體效價高達1∶27000，說明免疫小鼠能產生高親和力抗體，且部分抗體可特異性結合于菌體表面蛋白區域，初步實證了scFv作為飼料中革蘭氏陰性病原菌檢測物質和靶向抗菌藥物靶向定位區的可行性（Wang等，待發表）。此外，研究發現小鼠免疫6 d后，會有高濃度骨髓漿細胞產生，并在骨髓中較長時間內保持穩定（Reddy等，2010）。因此，小鼠免疫后第6天提取小鼠骨髓細胞總RNA，通過反轉錄獲得抗體可變區cDNA序列，以此為模板，以 VHF、VHR，VLF、VLR 為引物擴增 VH、VL 序列（圖 2）。

圖2 PCR擴增獲得抗體重鏈、輕鏈可變區及其連接linker序列

為保證抗體庫多樣性，VH上游用簡并引物，且VH、VL上下游引物均依據抗體可變區框架區設計（Luo 和 Xia，2012；Reddy 等，2010）。 最終獲得VH片段大小約為350 bp，VL片段大小約為700 bp（圖 2）， 與 Lee等 （2004） 報道相符。（Gly4Ser）3柔韌性很強，不會對抗體可變區二級結構及肽鏈折疊產生影響，具有維持天然抗體特異性結合性質的作用，其被作為linker廣泛用于scFv庫的構建。故隨后以VH、VL基因為模板，以VHF、VH+linker R，VLF、VL+linker F 為引物，PCR擴增后獲得VH+linker和VL+linker序列 （圖2）（Luo 和 Xia，2012）。

2.2 重疊延伸 PCR構建 VH+linker+VL（scFv）和VH+linker+VL+6His myc（scFv-6His myc）序列將膠回收純化的VH+linker和VL+linker序列等物質的量濃度混合，利用引物VHF和VLR進行重疊延伸PCR反應，結果如圖3所示。由圖3可見，VH與VL基因通過linker連接獲得scFv基因，即VH+linker+VL序列，片段大小約為1000 bp。以切膠回收純化的scFv基因為模板，用VHF和His-Rev VLR引物進行PCR擴增，獲得帶有6His標簽的scFv序列（scFv-6His）。在PCR擴增過程中發現，普通PCR和重疊延伸PCR效率都不高，非特異性擴增現象明顯，需要反復多次PCR擴增和瓊脂糖凝膠電泳后“切膠-回收-純化”富集目的序列。這可能與上、下游引物及文庫中scFv基因序列中的高GC含量有關（陳銳，2009）。

圖3 重疊延伸PCR和PCR獲得VH+linker+VL序列和VH+linker+VL+6His序列

圖4 重疊延伸PCR獲得VH+linker+VL+6His myc+gⅢ tether+3'loop序列和T7+5'loop+SD+VH+linker+VL+6His myc+gⅢ tether+3'loop序列

2.3 核糖體展示篩選高親和力scFv序列文庫的構建 核糖體展示中，完整的元件構建決定其體外轉錄翻譯效果。首先，為使展示蛋白更好地折疊，并與抗原蛋白結合，翻譯完成后完整蛋白需脫離核糖體但不能脫落，故展示蛋白基因C端需融合一段非結構蛋白基因“tether”，由此特殊肽段錨定核糖體。此外，為防止mRNA降解，在3'及5'端添加莖環結構，能夠將展示效率提高約15倍（Plückthun，2012）。 將 scFv-6His序列做膠回收純化后與合成的gⅢtether元件等物質的量濃度混合，利用引物VHF和T6te做重疊延伸PCR，獲得scFv+6His myc+gⅢtether+5'loop序列，約1300 bp（圖4）。在體外轉錄過程中還需要強啟動子（T7）以高效獲得RNA及SD序列以保證翻譯過程順利進行。故將所得序列膠回收純化后與合成的T7SD元件等物質的量濃度混合，并利用引物T7B和T6te進行重疊延伸PCR反應，結果顯示獲得完整核糖體展示序列，約1420 bp（圖4）。在此過程中非特異性擴增現象更加嚴重，或與兩端莖環結構有關，在重疊延伸PCR連接T7SD和gⅢtether過程中引物設計必須在莖環結構部分，這也可能是造成擴增效率不高的原因之一。在擴增過程中嘗試通過改變引物堿基數目改進，但效果不佳。最終采取多次擴增、切膠回收的方式獲得抗體庫。

3 結論

OmpC蛋白免疫BALB/c小鼠，獲得骨髓漿細胞。以其總RNA反轉錄獲得的cDNA為模板，PCR擴增獲得 VH和 VL， 并通過（Gly4Ser）3 linker連接兩片段，獲得scFv庫。通過重疊延伸PCR法添加T7啟動子、SD、gⅢ tether和兩端莖環結構等元件，最終成功構建針對大腸桿菌外膜蛋白C單鏈抗體核糖體展示文庫。為進一步通過核糖體展示法篩選高特異性、高親和力scFv抗體奠定了基礎，為飼料和其他領域革蘭氏陰性病原菌檢測及靶向抗菌劑和關聯藥物的靶向定位區的分子設計提供了新思路，也為其他關聯領域scFv抗體的制備提供了參考方法和材料基礎。

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