高效液相色譜-示差折光法測定飼料中低聚果糖含量

潘 城

（福建省產品質量檢驗研究院，福建福州 350002）

低聚果糖（FOS）又稱寡果糖或蔗果三糖族低聚糖。目前，低聚果糖的測定方法包括分光光度法、薄層色譜法、高效液相色譜法以及離子色譜法等。分光光度法和薄層色譜法易產生假陽性且定量誤差大，耗時較長；離子色譜法靈敏度較好，但是在電極表面糖類會發生氧化還原反應，從而影響方法的準確性；高效液相色譜法是常用的檢測方法，但是，低聚果糖在正常的紫外區和可見光范圍內沒有吸收，也沒有熒光，因此紫外檢測器和熒光檢測器不適于直接測定這類化合物。蒸發光檢測器和示差折光檢測器均可以用于低聚果糖的檢測，但蒸發光檢測器在各大企業實驗室還未完全普及，示差折光檢測器是檢測糖類物質的標準配置，易于普及應用。本實驗采用氨基鍵合相色譜柱與示差檢測器聯用技術，建立簡單、快速、準確的飼料中低聚果糖分離檢測技術，為飼料產品中低聚果糖的生產、應用和監管提供有效的技術支持。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 Waters 2695高效液相色譜儀配2414示差檢測器（美國 Waters公司）；DS-8510超聲波發生器 （上海生析超聲儀器有限公司）；Milli Q超純水制備器（美國Milipor公司）。

乙腈，色譜純（山東禹王實業有限公司），其他試劑為分析純。

低聚果糖標準品：蔗果三糖（純度≥99.0%），蔗果四糖 （純度≥99.0%）、蔗果五糖 （純度≥80.0%），均購于日本和光純藥工業株式會社。

1.2 標準儲備液和工作液配制 低聚果糖標準儲備液的配制：準確稱取蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖標準品200 mg，用超純水溶解并定容至10 mL，配制成濃度為20 mg/mL的標準儲備液。

標準工作溶液的配制：將低聚果糖的標準儲備液采用逐級稀釋的方法配制成濃度0.1～5 mg/mL的系列標準工作液，所有標準儲備液和標準工作液均置于0～4℃冰箱中保存。

1.3 樣品前處理 稱取飼料樣品5 g于100 mL的燒杯中，加入25 mL超純水，于超聲波振蕩器中超聲萃取20 min后，轉移至50 mL容量瓶中，加入200 g/L乙酸鋅溶液和100 g/L亞鐵氰化鉀溶液各1 mL沉淀蛋白，超純水定容至刻度。提取液經10000 r/min離心5 min后，取上清液，以0.45 μm濾膜過濾，濾液供分析用。

1.4 色譜條件 色譜柱：XB-NH2柱 （250 mm×4.6 mm，5 μm，美國 Welch 公司）；柱溫：35 ℃；流動相：乙腈∶水=65∶35（V/V）；流速 1.0 mL/min；進樣量10 μL。

1.5 計算方法 用外標法分別測定蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖的含量，上述三種組分糖含量的總和為樣品中低聚果糖的含量。

2 結果與討論

2.1 色譜條件優化 不同糖分子在氨基柱中形成了不同強度的氫鍵結合力，在分離時具有一定的優勢。因此本方法選用氨基柱作為分離色譜柱，同時選擇乙腈-水為流動相。實驗對比了不同乙腈-水比例對三種低聚果糖保留時間的影響，結果如圖 1 所示，采用乙腈-水（65∶35，V/V）進行等度洗脫可得到較好的分離效果。低聚果糖不具有紫外或熒光吸收基團，因此無法采用紫外或熒光檢測器進行檢測。本方法通過優化色譜條件，選用示差折光檢測器可得到較高的靈敏度。

圖1 低聚果糖標準溶液、飼料樣品和飼料樣品加標色譜圖

2.2 前處理條件優化 糖類具有較好的水溶性，實驗結合超聲波振蕩器可充分萃取樣品中的低聚果糖。提取液中的蛋白質等化合物會對測定樣品中的低聚果糖產生干擾，實驗通過選用乙酸鋅和亞鐵氰化鉀作為沉淀劑，降低了其他化合物對檢測準確性的影響。

2.3 線性方程、線性關系、檢出限及定量限 配制濃度為0.1～5 mg/mL低聚果糖系列標準工作溶液，以低聚果糖的峰面積對濃度進行線性回歸，回歸參數和最低檢測限見表1。結果表明，蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖在0.1～5 mg/mL具有很好的線性關系，相關系數R均為1.0000。以3倍信噪比（S/N=3）為檢出限，以10倍信噪比（S/N=10）為定量限，則蔗果三糖的檢出限為0.03 g/kg，其定量限0.10 g/kg；蔗果四糖的檢出限為0.04 g/kg，定量限為0.13 g/kg；蔗果五糖的檢出限為0.05 g/kg，定量限為0.15 g/kg。

表1 回歸參數和最低檢測限

2.4 回收率和精密度 在優化后的測定條件下，取飼料樣品進行加標回收實驗，加標水平分別為24.44、122.2、611.0 g/kg，每個水平重復分析 6 次，結果見表2。從表2可知，該方法的加標回收率為94.1% ～108.1%，相對標準偏差（RSD）為0.8% ～5.1%，結果表明，該方法適用于飼料中低聚果糖的日常分析檢測。

表2 低聚果糖加標回收實驗結果

3 結論

本實驗采用超聲萃取法結合高效液相色譜-示差折光檢測器，建立了飼料中低聚果糖含量的測定方法，有效地分離了蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖。該方法操作簡單，準確可靠，靈敏度高，適用于飼料樣品中低聚果糖含量的測定.