急性缺氧對(duì)環(huán)匹阿尼酸誘導(dǎo)的大鼠遠(yuǎn)端肺靜脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣濃度升高的影響

彭公永，胡國(guó)平，趙祝香，胡錦興，鄒義敏，彭芳

急性缺氧對(duì)環(huán)匹阿尼酸誘導(dǎo)的大鼠遠(yuǎn)端肺靜脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣濃度升高的影響

彭公永，胡國(guó)平，趙祝香，胡錦興，鄒義敏，彭芳

急性缺氧；環(huán)匹阿尼酸；肺靜脈平滑肌細(xì)胞；細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度；鈣池操縱性鈣通道

(Chinese Circulation Journal, 2015,30:800.)

在肺循環(huán)中，肺靜脈不僅僅是毛細(xì)血管氧合后的血流入左心房的通道，而且參與調(diào)節(jié)肺泡壁毛細(xì)血管的充盈和復(fù)張，并和肺動(dòng)脈一起參與調(diào)節(jié)肺通氣/灌注，肺動(dòng)脈和肺靜脈的收縮均可導(dǎo)致肺血管阻力升高。盡管肺靜脈具有生理重要性，但肺靜脈的收縮反應(yīng)較少受到關(guān)注，肺靜脈及肺靜脈平滑肌細(xì)胞（PVSMC）的缺氧性變化尚未引起重視。以往實(shí)驗(yàn)表明：急性缺氧可導(dǎo)致包括大鼠、綿羊、雪貂、豬、狗等多種動(dòng)物肺靜脈的強(qiáng)烈收縮[1,2]，但其具體機(jī)制尚不清楚。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

Ⅰ型膠原酶、氯化鈉（NaCl）、氯化鉀（KCl）、氯化鈣（CaCl2）、硫酸鎂（MgSO4）、磷酸二氫鉀（KH2PO4）、碳酸氫鈉（NaHCO3）、CPA、氯化鎳（NiCl2）、SKF 96365、葡萄糖、硝苯地平（美國(guó)Sigma公司）；磷酸鹽緩沖液（PBS）、胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司）；Fura-2 AM（美國(guó)Invitrogen公司）；顯微鑷、顯微剪（上海金鐘公司）；體式顯微鏡、熒光顯微鏡（日本Nikon公司）；細(xì)胞內(nèi)鈣濃度檢測(cè)系統(tǒng)（美國(guó)Intracellular Imaging公司）；雙通道溫度控制系統(tǒng)（美國(guó)Warner Instrument公司）。

1.2 大鼠遠(yuǎn)端肺靜脈平滑肌細(xì)胞原代培養(yǎng)

采用筆者已經(jīng)報(bào)道的方法[6-8]，6只雄性SD大鼠（體重200～250 g）腹腔注射2%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉后，開胸取心、肺，于體式顯微鏡下用顯微鑷和顯微剪分離遠(yuǎn)端肺靜脈（4級(jí)分支以下），用Ⅰ型膠原酶消化法原代培養(yǎng)并鑒定大鼠遠(yuǎn)端PVSMC。

1.3 細(xì)胞內(nèi)鈣濃度測(cè)定

參照文獻(xiàn)[6-8]，PVSMC生長(zhǎng)至50%～60%融合，用5 μmol/L Fura-2 AM 37℃避光負(fù)載細(xì)胞1 h，固定長(zhǎng)有細(xì)胞的蓋玻片于熒光顯微鏡上的觀測(cè)盒內(nèi)，以0.5～1 ml/min的流速用Krebs溶液（含118 mmol/L NaCl、4.7 mmol/L KCl、2.5 mmol/L CaCl2、0.57 mmol/L MgSO4、1.18 mmol/L KH2PO4、25 mmol/L NaHCO3和10 mmol/L葡萄糖）灌流孵育細(xì)胞15 min，以含16%O2、5%CO2的混合氮?dú)獬掷m(xù)平衡Krebs灌流液，用雙通道溫度控制系統(tǒng)控制觀測(cè)盒溫度37～37.2℃，打開熒光顯微鏡和細(xì)胞內(nèi)鈣濃度檢測(cè)系統(tǒng)，實(shí)時(shí)記錄數(shù)據(jù)。

1.4 急性缺氧對(duì)環(huán)匹阿尼酸誘導(dǎo)的大鼠遠(yuǎn)端肺靜脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣濃度升高的影響

實(shí)驗(yàn)分常氧組和缺氧組。兩組細(xì)胞先分別用16%O2、5%CO2的混合氮?dú)獬掷m(xù)平衡的Krebs溶液灌流孵育5 min，然后，常氧組先用16%O2、5%CO2的混合氮?dú)獬掷m(xù)平衡的含10 μmol/L CPA、5 μmol/L硝苯地平（電壓依賴鈣通道阻斷劑）無鈣Krebs液（118 mmol/L NaCl、4.7 mmol/L KCl、0.57 mmol/L MgSO4、1.18 mmol/L KH2PO4、25 mmol/L NaHCO3和10 mmol/L葡萄糖）孵育10 min，再用16%O2、5%CO2的混合氮?dú)獬掷m(xù)平衡的含10 μmol/L CPA、5 μmol/L硝苯地平的Krebs液孵育15 min，缺氧組先換用4%O2、5%CO2的混合氮?dú)獬掷m(xù)平衡的含10 μmol/L CPA、5μmol/L硝苯地平無鈣Krebs液孵育10 min，再用4%O2、5%CO2的混合氮?dú)獬掷m(xù)平衡的含10 μmol/L CPA、5 μmol/L硝苯地平Krebs液孵育15 min，最后，兩組細(xì)胞分別用16%O2、5%CO2的混合氮?dú)獬掷m(xù)平衡Krebs液孵育10 min。

1.5 氯化鎳、SKF96365對(duì)急性缺氧作用的干預(yù)

NiCl2和SKF96365均為SOCC阻斷劑。實(shí)驗(yàn)分對(duì)照組、NiCl2干預(yù)組和SKF96365干預(yù)組。三組細(xì)胞先分別用16%O2、5%CO2的混合氮?dú)獬掷m(xù)平衡的Krebs溶液灌流孵育5 min，對(duì)照組先以4%O2、5%CO2的混合氮?dú)獬掷m(xù)平衡的含10 μmol/L CPA、 5 μmol/L硝苯地平無鈣Krebs液孵育10 min，再以4%O2、5%CO2的混合氮?dú)獬掷m(xù)平衡的含10 μmol/L CPA、5 μmol/L硝苯地平Krebs液孵育15 min；而NiCl2干預(yù)組和SKF96365干預(yù)組在相同時(shí)相的灌流液中分別加入500 μmol/L NiCl2和50 μmol/L SKF96365，其余處理與對(duì)照組相同，最后，各組均以16%O2、5%CO2的混合氮?dú)獬掷m(xù)平衡Krebs液孵育10 min。

1.6 氯化鎳、SKF96365對(duì)高鉀引起的肺靜脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣濃度升高的影響

參照文獻(xiàn)[9,10]，實(shí)驗(yàn)分對(duì)照組、NiCl2干預(yù)組和SKF96365干預(yù)組。各組細(xì)胞先用16%O2、5%CO2的混合氮?dú)獬掷m(xù)平衡的Krebs液孵育5 min，然后用16%O2、5%CO2的混合氮?dú)獬掷m(xù)平衡的高鉀Krebs液（60 mmol/L KCl、60 mmol/L NaCl、2.5 mmol/L CaCl2、0.57 mmol/L MgSO4、1.18 mmol/L KH2PO4、25 mmol/L NaHCO3和10 mmol/L葡萄糖）孵育10 min，NiCl2干預(yù)組和SKF96365干預(yù)組在相同時(shí)相灌流液中分別加入500 μmol/L NiCl2和50 μmol/L SKF96365，其余處理與對(duì)照組相同，最后，三組細(xì)胞分別用Krebs液孵育10 min。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 急性缺氧對(duì)環(huán)匹阿尼酸誘導(dǎo)的大鼠遠(yuǎn)端肺靜脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣濃度升高的影響（圖1）

圖1 急性缺氧對(duì)環(huán)匹阿尼酸誘導(dǎo)的大鼠遠(yuǎn)端肺靜脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣濃度升高的影響（n = 6）

2.2 氯化鎳、SKF96365對(duì)急性缺氧作用的干預(yù)（圖2）

2.3 氯化鎳、SKF96365對(duì)高鉀引起的肺靜脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的影響（圖3）

圖2 氯化鎳和SKF96365對(duì)急性缺氧條件下環(huán)匹阿尼酸誘導(dǎo)的肺靜脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣濃度升高的影響（n=6）

圖3 氯化鎳和SKF96365對(duì)高鉀引起的大鼠遠(yuǎn)端肺靜脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣濃度升高的影響（n=6）

3 討論

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[3] Yamamura A, Yamamura H, Guo Q, et al. Dihydropyridine Ca2+channel blockers increase cytosolic [Ca2+] by activating Ca2+-sensing receptors in pulmonary arterial smooth muscle cells. Circ Res, 2013, 112: 640-650.

[4] 承偉, 李智. 釕紅、丁卡因?qū)Ψ蝿?dòng)脈高壓模型大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞釋放功能的影響. 中國(guó)循環(huán)雜志, 2012, 27: 149-152.

[5] 趙剛, 宋明寶, 于學(xué)軍, 等. 鈣離子跨縫隙連接在內(nèi)皮細(xì)胞與平滑肌細(xì)胞間傳遞的研究. 中國(guó)循環(huán)雜志, 2013, z（1）: 52.

[6] 彭公永, 周玉民, 蔣永亮, 等. 急性缺氧對(duì)大鼠遠(yuǎn)端肺靜脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的影響. 解剖學(xué)雜志, 2013, 36: 305-308.

[7] 彭公永, 蔣永亮, 胡國(guó)平, 等. 環(huán)匹阿尼酸對(duì)大鼠遠(yuǎn)端肺靜脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣濃度 的影響. 廣東醫(yī)學(xué), 2012, 33: 3511-3514.

[8] Peng G, Wang J, Lu W, et al. Isolation and primary culture of rat distal pulmonaryvenous smooth muscle cells. Hypertens Res, 2010, 33: 308-313.

[9] Wang J, Shimoda LA, Weigand L, et al. Acute hypoxia increases intracellular [Ca2+] in pulmonary arterial smooth muscle by enhancing capacitative Ca2+entry.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2005, 288: L1059-1069.

[10] 彭公永, 周玉民, 胡國(guó)平, 等. 原代培養(yǎng)的大鼠遠(yuǎn)端肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的功能研究.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào), 2012, 28: 1570-1573.

[11] Peng G, Lu W, Li X, et al. Expression of Store-operated Ca2+ entry and transient receptor potential canonical and vanilloid-related proteins in rat distal pulmonary venous smooth muscle. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2010, 299: L621-630.

Effect of Acute Hypoxia on Cyclopiazonic Acid Induced Intracellular Calcium Cation Enhancement in Rat Distal Pulmonary Venous Smooth Muscle Cells

PENG Gong-yong, HU Guo-ping, ZHAO Zhu-xiang, HU Jin-xing, ZOU Yi-min, PENG Fang.
National Key Laboratory of Respiratory Disease, Guangzhou Institute of Respiratory Diseases, The First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou (510120), Guangdong, China

Acute hypoxia; Cyclopiazonic acid; Pulmonary venous smooth muscle cells; Intracellular calcium cation concentration; Store-operated Ca2+channels

2014-12-01）

（編輯：許 菁）

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81000020，81570045）；廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2014A030313486）；廣州市科技計(jì)劃資助項(xiàng)目（201510010226）；羊城學(xué)者科研計(jì)劃學(xué)術(shù)骨干項(xiàng)目（10A025G）；廣州市屬高校科研項(xiàng)目（10A276）；呼吸疾病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室青年科學(xué)基金支持項(xiàng)目（11）

510120 廣東省廣州市，廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 廣州呼吸疾病研究所呼吸疾病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

彭公永 副主任醫(yī)師 博士 主要從事肺血管疾病基礎(chǔ)與臨床研究 Email: gongyong19761@163.com 通訊作者：彭公永

R54

A

1000-3614（2015）08-0800-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2015.08.020