吡哆胺和替米沙坦對自發性高血壓大鼠心肌重塑相關指標的影響

鄭煒平，朱鵬立，李峰，余惠珍，林帆，林虹，林開陽

吡哆胺和替米沙坦對自發性高血壓大鼠心肌重塑相關指標的影響

鄭煒平，朱鵬立，李峰，余惠珍，林帆，林虹，林開陽

目的: 觀察單用及聯用吡哆胺和替米沙坦對自發性高血壓大鼠（SHR）心肌重塑相關指標的影響。

方法: 48只22周齡雄性SHR，隨機分為4組，12只/組。高血壓對照組（H組）予以蒸餾水2 ml/d、替米沙坦組（T組）予以替米沙坦6 mg/ （kg·d）、吡哆胺組（P組）予以吡哆胺200 mg/ （kg·d）、聯合干預組（TP組）予以替米沙坦6 mg/ （kg·d）+吡哆胺200 mg/ （kg·d）灌胃。測定干預前后大鼠尾動脈收縮壓。干預16 W后，化學發光法檢測血清一氧化氮（NO）、超氧化物歧化酶（SOD），酶聯免疫吸附測定法檢測血清晚期糖基化終末產物（AGEs），計算左心室重量指數，計算心肌膠原容積分數，實時定量聚合酶鏈式反應（PCR）檢測心肌晚期糖基化終末產物受體（RAGE）信使核糖核酸（mRNA）表達水平。

結果: 與H組相比，T組、TP組收縮壓下降（P ＜0.01），P組收縮壓無明顯改變（P＞0.05 ）；與H組相比，T組、P組、TP組血清NO、SOD濃度升高（P ＜0.01）；與T組、P組相比，TP組血清NO濃度、SOD濃度進一步升高（P ＜0.05）。與H組相比，T組、P組、TP組左心室重量指數、心肌膠原容積分數降低（P ＜0.01）；與T組、P組相比，TP組左心室重量指數、心肌膠原容積分數進一步降低（P＜0.05）。與H組（6.71±0.50） mg/L相比，T組（5.99±0.51） mg/L、P組（5.57±0.91）mg/L、TP組（5.24±0.63） mg/L血清AGEs降低（P ＜0.01）；與T組、P組相比,TP組血清AGEs進一步降低（P＜0.05）。吡哆胺和替米沙坦兩因素在左心室重量指數、心肌膠原容積分數中存在協同效應 （P ＜0.05）。與H組（0.053±0.010）相比,T組（0.035±0.010）、P組（0.036±0.005）、TP組（0.024±0.007）RAGE mRNA表達水平降低（P ＜0.01）；與T組、P組相比,TP組RAGE mRNA表達水平進一步降低（P ＜0.05）。差異均有統計學意義。

結論：吡哆胺有獨立于降壓因素之外的改善SHR體內氧化應激狀態、改善心肌重塑相關指標的作用，聯用吡哆胺和替米沙坦可以從不同途徑打破氧化應激介導的AGEs-RAGE和腎素—血管緊張素系統的協同作用，進一步改善心肌重塑相關指標。

晚期糖基化終末產物； 吡哆胺； 替米沙坦； 自發性高血壓大鼠

Methods: A total of 48 male SHR at 22 weeks of age were randomly divided into 4 groups: ①Hypertension （H）control group, the rats received distilled water 2 ml/d,②telmisartan （T） group, the rats received telmisartan 6 mg/（kg.d）,③pyridoxamine （P） group, the rats received pyridoxamine 200 mg/（kg.d）, ④Combination （TP） group, the rats received both telmisartan and pyridoxamine. All animals were treated for 16 weeks and the systolic blood pressure （SBP） was measured before and after treatment. After treatment, the serum levels of nitric oxide （NO） and super oxide dismutase （SOD） were examined by chemiluminescent method, advanced glycation end-products （AGEs） was detected by ELISA, left ventricular weight index and collagen volume fraction （CVF） in myocardial tissue were calculated, the mRNA expression of myocardial

receptor of advanced glycation end products （RAGE） was evaluated by real time RT-PCR.

Results: Compared with H group, SBP levels were decreased in T and TP groups, P＜0.01, while SBP in P group stayed similar, P＞0.05. Compared with H group, the serum levels of NO and SOD were increased in T, P and TP groups, P＜0.01; while compared with T group and P group, the levels of NO and SOD were further increased in TP group, P＜0.05. Compared with H group, left ventricular weight index and CVF were decreased in T, P and TP groups, P＜0.01; while compared with T group and P group, left ventricular weight index and CVF were further decreased in TP group, P＜0.05. Pyridoxamine and telmisartan had the coordinative effect on left ventricular weight index and CVF, P＜0.05. The serum levels of AGEs were lower in T group （5.99 ± 0.51） mg/L, P group （5.57 ± 0.91） mg/L and TP group （5.24 ± 0.63） mg/L than that in H group, （6.71 ± 0.50） mg/L, P＜0.01; while compared with T group and P group, AGEs was further decreased in TP group, P＜0.05. The mRNA expressions of RAGE were reduced in T group （0.035 ± 0.010）, P group （0.036 ± 0.005） and TP group （0.024 ± 0.007）than that in H group （0.053 ± 0.010）, P ＜0.01; while compared with T group and P group, the mRNA of RAGE was further reduced in TP group, P＜0.05.

Conclusion: Pyridoxamine could improve the oxidative stress and the indexes of myocardial remodeling independently from decreasing blood pressure in SHR. Combined intervention of P and T may break the coordination systems between AGEs-RAGE and renin-angiotensin, therefore further improve the indexes of myocardial remodeling in SHR.

（Chinese Circulation Journal, 2015,30:689.）

胰島素抵抗是高血壓重要的發病機制之一。胰島素抵抗導致體內晚期糖基化終末產物（advanced glycation end products，AGEs）水平增高[1]。高血壓患者體內AGEs水平明顯高于正常人[2]。AGEs是體內葡萄糖通過非酶性糖基化反應（Maillard反應）與蛋白質、脂肪酸或核酸交聯而成的一大類穩定的有生物學活性的聚合物，其主要受體為晚期糖化終末產物受體（receptor of advanced glycation end products，RAGE）[3]。高血壓病心肌重塑是心力衰竭、心律失常、猝死等并發癥的病理生理基礎。本研究通過吡哆胺、替米沙坦干預自發性高血壓大鼠（SHR），檢測干預組與對照組血清一氧化氮（NO）、超氧化物歧化酶（SOD）、AGEs水平，心肌顯微形態、左心室重量指數、心肌膠原分數及心肌RAGE信使核糖核酸（mRNA）表達水平，了解吡哆胺、替米沙坦對SHR心肌重塑相關指標的影響，探討其可能機制。

1 材料與方法

實驗時間：2009-01至2011-01。實驗動物：48只SPF級別SHR大鼠（雄性，22周齡）購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，許可證號：SCXK（滬）2007-0005，飼養于福建醫科大學實驗動物中心SPF屏障系統， 許可證號：SYXK（閩）2008-0001。

主要試劑和儀器：替米沙坦（德國勃林格殷格翰公司，批號807856），吡哆胺（美國BIOFER公司 批號：09549 CAS-NO）。AGEs 酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（美國R&D）。SOD試劑盒、NO試劑盒（南京建成生物工程研究所）。總核糖核酸（RNA）抽提試劑盒（上海飛捷生物技術有限公司）、逆轉錄試劑盒（美國Fermentas公司）、實時定量聚合酶鏈式反應（PCR）試劑盒（廣州東盛生物科技有限公司）。TakaRa TP 800型實時熒光定量PCR儀（日本TaKaRa 公司）。大鼠尾動脈收縮壓無創血壓計（BP-98AL，日本Softron）。

分組與干預：48只SHR隨機分為高血壓對照組（H組）、替米沙坦組（T組）、吡哆胺組（P組）、聯合干預組（TP組），每組12只。H組予蒸餾水2 ml/d 灌胃，T組予替米沙坦6 mg/ （kg·d）灌胃，P組予吡哆胺200 mg/ （kg·d）灌胃，TP組予替米沙坦6 mg/ （kg·d）+吡哆胺200 mg/ （kg·d）灌胃。各組大鼠干預時間16 W。每兩周于同一時間點檢測大鼠尾動脈收縮壓直至實驗結束。

血液標本采集及測定：干預16 W后，麻醉SHR，腹主動脈采動脈血5 ml，離心后4℃保存，待測NO、SOD；-80℃保存，待測AGEs。血清NO采用硝酸還原法、血清SOD采用超微量快速測定法、血清AGEs采用競爭性ELISA法檢測。操作均嚴格按說明書要求進行。

左心室重量指數計算：電子計量秤稱取大鼠體重，麻醉后，解剖剝離雙側心房和右心室，濾紙吸干后稱取左心室重量，將左心室重量（mg）除以體重（g），即為左心室重量指數（mg/g）。

心肌膠原容積分數測定：各組切片用醫學圖像分析系統（IPPS）進行半定量分析，400倍高倍鏡下隨機取4個視野，并通過灰度調節區別膠原與非膠原成分。測量心室心肌膠原面積和統計場總面積，心肌膠原容積分數=心室心肌膠原面積/統計場總面積×100%。

心肌顯微形態學觀察：取心室乳頭肌處心肌標本，厚度約5 mm，經固定、包埋、切片、展片、干燥后，以苦味酸—天狼星紅染液中浸染、蘇木素伊紅復染、無水酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。在400倍光學顯微鏡下觀察各實驗組SHR心臟切片心肌細胞排列情況，細胞大小、形態、膠原纖維增生情況。

心肌RAGE mRNA表達水平測定：取心室乳頭肌處心肌標本， Real-time PCR檢測RAGE mRNA表達水平。按TRIzol說明書提取總RNA，進行逆轉錄和PCR反應，引物序列為5'-CTCCTGTCAACATCAGGGTCAC-3'和5'-GATCCCTAAGGCCAGGGCTA-3'，由大連寶生物公司設計與合成。樣品與標準品同時在TaKaRa Code TP800進行分析處理，分別對目的基因和內參基因標準品做2條標準曲線。得到內參基因Ct值與目的基因Ct值經相應基因標準曲線進行換算，得出各自的起始模板量（校正值＝目的基因始模板量/內參基因始模板量）。

2 結果

一般結果： T組、TP組各有2只SHR因打斗、麻醉意外死亡，共44只SHR完成實驗。計量數據經統計學檢驗符合正態、等方差。

各實驗組大鼠收縮壓變化情況：與H組收縮壓[（199.67±13.07）mmHg，1 mmHg=0.133 kPa]相比T組[（133.00±15.55）mmHg]、TP組[（131.30±14.25）mmHg] 收縮壓明顯下降（P＜0.01），P組收縮壓[（198.30±13.36）mmHg]無明顯改變（P ＞0.05 ）；T組與TP組相比收縮壓差異無統計學意義（P ＞0.05 ）。

各實驗組大鼠NO、SOD、AGEs、左心室重量指數、膠原容積分數檢測值比較（表1）：與H組相比，T組、P組、TP組血清NO、SOD濃度升高，差異有統計學意 義（P＜0.01）；與T組、P組相比，TP組血清NO濃度、SOD濃度進一步升高（P＜0.05）。與H組相比，T組、P組、TP組AGEs、左心室重量指數、心肌膠原容積分數均降低（P＜0.01）；與T組、P組相比，TP組AGEs、左心室重量指數、心肌膠原容積分數進一步降低，差異有統計學意 義（P＜0.05）。

表1 各實驗組大鼠一氧化氮、超氧化物岐化酶、晚期糖基化終末產物、左心室重量指數、膠原容積分數檢測值比較

表1 各實驗組大鼠一氧化氮、超氧化物岐化酶、晚期糖基化終末產物、左心室重量指數、膠原容積分數檢測值比較

注：H組：高血壓對照組，T組：替米沙坦組，P組：吡哆胺組，TP組：聯合干預組。與H組相比*P＜0.01；與T組相比△P＜0.05；與P組相比▲P＜0.05

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替米沙坦、吡哆胺干預對左心室重量指數、心肌膠原容積分數影響的雙因素方差分析（表2、表3）：對T組、P組、TP組血清NO、SOD、血清AGEs、左心室重量指數、心肌膠原容積分數以是否加用替米沙坦和吡哆胺兩個因素進行雙因素方差分析，發現這兩個因素在左心室重量指數、心肌膠原容積分數中存在協同效應（P＜0.05），差異均有統計學意義。

表2 替米沙坦、吡哆胺干預對左心室重量指數影響的雙因素方差分析

表3 替米沙坦、吡哆胺干預對心肌膠原容積分數影響的雙因素方差分析

各實驗組大鼠心肌顯微形態學觀察（圖1）：H組較T組、P組、TP組心肌細胞排列紊亂，細胞增生、肥大，細胞外膠原纖維增生增多。

各實驗組大鼠RAGE mRNA的RT-PCR相對定量比較：與H組（0.053±0.010）相比，T組（0.035±0.010）、P組（0.036±0.005）、TP組（0.024±0.007）RAGE mRNA表達水平均降低（P＜0.05）；與T組、P組相比TP組RAGE mRNA表達水平進一步降低（P＜0.05）。差異均有統計學意義。

圖1 各實驗組大鼠心肌苦味酸—天狼星紅染色結果（×400）

3 討論

高血壓病的發生、發展過程也是其靶器官進行性損害的過程。心臟是高血壓病的重要靶器官之一，心肌重塑是一個漸進的過程，早期心肌重塑對血液動力學負荷可適應性代償，但到后期，進展到心室肥厚，導致心臟收縮和舒張功能障礙，則成為心力衰竭發生、發展的基礎。心肌重塑表現為心臟重量增加，心肌體重指數升高、左心室肥厚、左心室容積增大等。組織變化特征為心肌細胞肥大、排列紊亂、Ⅰ/Ⅲ型膠原纖維比例增高[4]。

AGEs可通過修飾心肌膠原蛋白使其交聯增加、不易降解，引起心肌重塑。Candido等[5]的研究表明存在胰島素抵抗的大鼠心臟AGEs修飾的膠原明顯增加，膠原可溶性降低，膠原交聯增加，Ⅰ/Ⅲ型膠原纖維比例增高， 左心室重量指數增加，上述情況可以被AGEs阻滯劑ALT-711改善。AGEs可以滅活體內抗氧化物質NO、SOD，促進活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）集聚，加重體內氧化應激狀態[6]，氧化應激是心肌重塑的重要機制之一。AGEs與RAGE結合可激活纖維性細胞因子、結締組織生長因子和轉化生長因子β1導致心肌纖維化，引起心肌重塑[7]。hhlim基因是與心臟生長發育有關的基因，可以促進心肌細胞增生、肥大，主要在心肌細胞中表達[8]，在心肌肥厚大鼠的心肌細胞中hhlim基因表達活性增強[9]。邵亞輝等[10]的研究發現用AGEs刺激乳鼠心肌細胞可導致hhlim基因蛋白的表達增加， 說明AGEs通過其受體RAGE介導參與心肌肥厚和左心室重塑。

吡哆胺是一種自由基清除劑， 可能通過抑制氧化應激而減少AGEs的形成[11]。羰基化合物能明顯加速AGEs的形成，吡哆胺作為親核化合物可清除羰基化合物，是吡哆胺抑制AGEs形成的一種可能機制[5]。目前已有多個獨立研究證實吡哆胺能強力抑制體外及體內AGEs的產生[12，13]。本研究也發現吡哆胺干預后SHR血壓無明顯下降，但血清NO、SOD水平明顯升高、AGEs明顯下降，左心室重量指數、心肌膠原容積分數指標改善，提示吡哆胺獨立于降壓因素之外的改善SHR大鼠心肌重塑的作用。

替米沙坦作為血管緊張素Ⅱ的1型（AT1）受體拮抗劑，其在高血壓病中的降壓、抗氧化應激及抑制心肌重塑的作用已為眾多研究所證實。本研究提示聯用替米沙坦、吡哆胺對降低SHR左心室重量指數、心肌膠原容積分數，改善心肌重塑有協同作用，可能與吡哆胺與替米沙坦可以從不同途徑打破氧化應激介導的腎素—血管緊張素系統和AGEs-RAGE的協同作用有關。血管緊張素Ⅱ可以使氧化應激的關鍵酶尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶

（NADPH oxidase，NOX）被異常激活，產生過量活性氧簇[14]。對內皮細胞和血管平滑肌細胞的研究表明，血管緊張素Ⅱ可通過作用于NOX復合體多個亞基，增加該酶的活性，從而增加ROS的產生[15]。在心肌組織中，血管緊張素Ⅱ主要通過糜酶途徑所產生，AGEs-RAGE可以通過氧化應激介導的ERK1/2通路使由糜酶途徑所產生的血管緊張素Ⅱ增多。Koka等[16]的研究發現局部組織AGEs、細胞外調節蛋白激酶（ERK）、促分裂素原活化蛋白激酶（MAPK）隨著糜蛋白酶的含量增高而增高。Sebeková等[17]的研究發現氧化應激狀態下AGEs合成增多。AGEs與RAGE結合，通過к基因結合核因子（NF-кB）、蛋白激酶C （PKC）、或其他途徑刺激多種細胞分泌細胞因子和生長因子，促進炎癥反應和氧化應激過程，形成一個自我放大的惡性循環過程[18]。因此氧化應激既是AGEs-RAGE和腎素—血管緊張素系統對心血管的共同損傷機制又是AGEs-RAGE和腎素—血管緊張素系統相互協同作用的通路。

綜上所述，吡哆胺有獨立于降壓因素之外的改善SHR體內氧化應激狀態、改善心肌重塑相關指標的作用，聯用吡哆胺和替米沙坦可以從不同途徑打破氧化應激介導的AGEs-RAGE和腎素—血管緊張素系統的協同作用，進一步改善心肌重塑相關指標。

[1] 馮燕, 王顏剛, 王沖, 等. 初診2型糖尿病患者血清晚期糖基化終末產物與胰島β細胞早相分泌功能及胰島素抵抗的關系. 中華糖尿病雜志, 2012，4: 106-110.

[2] McNuty M，Mahmud A，Feely J. Advanced glycation end-products and arterial stiffness in hypertension. Am J Hypertens，2007，20: 242-247．

[3] Ulrich P, Cerami A. Protein glycation, diabetes, and aging. Recent Prog Horm Res, 2001, 56: 1-21.

[4] Ma F, Li Y, Jia L，et al. Macrophage-stimulated cardiac fibroblast production of IL-6 is essential for TGF-b/Smad activation and cardiac fibrosis induced by angiotensin II．PLoS One, 2012, 7: e35144．

[5] Candido R, Forbes JM, Thomas MC, et al. A breaker of advanced glycation end products attenuates diabetes-induced myocardial structural changes. Circ Res, 2003, 92: 785-792.

[6] 劉亞洋, 李鶴, 吳宗貴，等．晚期糖基化終產物對大鼠血管外膜成纖維細胞中煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶p22phox亞基及活性氧表達的影響．中國循環雜志，2012，27: 228-231.

[7] Aragno M，Mastrocola R，Alloatti G，et al．Oxidative stress triggers cardiac fibrosis in the heart of diabetic rats．Endocrinology, 2008，149: 380-388．

[8] Molkentin JD. The zinc finger containing transcription factors GATA-4, -5 and-6. Biol Chem, 2000, 275: 38940-38952.

[9] Zheng B, Wen JK, Han M. hhLIM is a novel F-actin binding protein involved in actin cytoskeleton remodeling. FEBS J, 2008, 275: 1568-1578.

[10] 邵亞輝, 許頂立. 糖基化終極產物對心血管系統的損傷作用及干預措施 . 中國分子心臟病學雜志，2004，17: 253-256.

[11] Jain SK, Lim G. Pyridoxine and pyridoxamine inhibits superoxide radicals and prevents lipid peroxidation, protein glycosylation, and（Na++ K+）-ATPase activity reduction in high glucose-treated human erythrocytes. Free Radical Biol Med, 2001, 300: 232-237.

[12] Voziyan PA, Metz TO, Baynes JW, et al. A post-Amadori inhibitor pyridoxamine also inhibits chemical modification of proteins by scavenging carbonyl intermediates of carbohydrate and lipid degradation. Biol Chem, 2002, 277: 3397-3403.

[13] Culbertson SM, Enright GD, Ingold KU. Synthesis of a novel radical trapping and carbonyl group trapping anti-AGE agent: a pyridoxamine analogue for inhibiting advanced glycation （AGE） and lipoxidation（ALE） end products. Org Lett，2003, 5: 2659-2662.

[14] 劉雪平，張桂茹，祝瑋瑋，等．貝那普利對老齡自發性高血壓大鼠血管糖基化終末產物形成及血管損傷的抑制．中國循環雜志，2008，23: 139-142．

[15] Wei Y, Whaley-Connell AT, Chen K, et al. NADPH oxidasecontributes to vascular inflammation, insulin resistance, and re-modeling in the transgenic （mRen2 ） rat. Hypertension, 2007, 50: 384-391.

[16] Koka V, Wang W, Huang XR, et al. Advanced glycation end products activate a chymase-dependent angiotensin II-generating pathway in diabetic complications. Circulation, 2006, 113: 1353-1360.

[17] Sebeková K, Blazícek P, Syrová D, et al. Circulating advanced glycation end product levels in rats rapidly increase with acute renal failure. Kidney Int Suppl, 2001, 59: S58-62.

[18] 陳建康，朱鵬立，余惠珍，等．吡哆胺和替米沙坦對人腎小管上皮細胞活性氧生成的影響．中國醫科大學學報，2011，40: 1121-1124．

Effect of Pyridoxamine and Telmisartan on the Indexes of Myocardial Remodeling in Spontaneous Hypertensive Rats

ZHENG Wei-ping, ZHU Peng-li, LI Feng, YU Hui-zhen, LIN Fan, LIN Hong, LIN Kai-yang.
Department of Geriatric Medicine, Fujian Provincial Hospital, Fujian Medical University, Fuzhou （350001）, Fujian, China

Objective: To observe the effect of pyridoxamine and telmisartan on the indexes of myocardial remodeling in spontaneous hypertensive rats （SHR）.

Advanced glycation end products; Pyridoxamine; Telmisartan; Spontaneous hypertensive rats

2014-12-14）

（編輯：漆利萍）

福建省自然科學基金（20l0J0ll27）

350001 福建省福州市，福建省立醫院 老年科 福建醫科大學省立臨床醫學院 福建省臨床老年病研究所

鄭煒平 副主任醫師 碩士 主要從事心血管內科工作 Email：sycdxy66@163.com 通訊作者：朱鵬立 Email：zpl7755@126.com

R541

A

1000-3614（2015）07-0689-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2015.07.018