宮頸癌分子遺傳機制及其相關基因功能研究

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宮頸癌分子遺傳機制及其相關基因功能研究

張懷念，張詠莉

(廣東藥學院，廣東 廣州510006)

摘要:宮頸癌是婦科中最為常見的惡性腫瘤之一，其發病率在女性惡性腫瘤中位居第二，僅次于乳腺癌。目前宮頸癌的治療效果并不佳，并且其具體的致病機制尚不清楚。為了闡述對宮頸癌預防及治療有意義的新的靶點，該文主要從分子水平綜述其相關致病機制及其涉及到的相關基因。目前研究比較新的宮頸癌發病機制涉及有微小RNA(mi RNA)，DNA甲基化等方面，這些基因靶點在宮頸癌的發生、發展、診斷、治療及預后等各個環節中起到關鍵作用。

關鍵詞:宮頸癌；致病機制；相關基因；微小RNA；DNA甲基化

宮頸癌是全球女性中最為常見的惡性腫瘤之一，其嚴重的影響到了婦女的生命活動[1-2]。在中國，每年大約有13.5萬新病例和8萬人由于宮頸癌疾病而死亡，此外，在年輕的中國女性中(小于30歲)，宮頸癌的發病率以每年2%~3%持續增加[3]。雖然人類乳頭瘤病毒(HPV)被認為是宮頸癌的主要致病因素，然而，病毒感染本身不足引起癌癥的發生。宮頸癌的發病機制尤為復雜，對女性危害極為嚴重，因此準確地了解宮頸癌致病的分子機制，對宮頸癌預防、治療是必不可少的[4]。近些年來，mi RNA、DNA甲基化等在宮頸癌發病中的作用成為關注的熱點，因此，本文就其二者在宮頸癌發病中的研究現狀加以綜述。

1mi RNA在宮頸癌致病機制研究中的應用和進展

1.1mi RNA概述mi RNA是在真核細胞中發現的一種內源性的起著調控作用的單鏈非編碼 RNA，長約22～25個核苷酸。由內含子中的mi RNA轉錄形成原始的mi RNA，經過一系列剪切加工成成熟的 mi RNA，隨后組裝進RNA誘導的沉默復合體，再通過堿基互補配對的方式與靶m RNA 結合，最終參與基因轉錄后表達調控。相關研究表明，50%以上mi RNA基因定位于基因脆性位點或腫瘤相關基因組區域，mi RNA通過促使靶m RNA降解或抑制其翻譯來調節靶基因的表達，在細胞的分化、增殖、凋亡、機體代謝以及腫瘤的發生、轉移過程中發揮著重要作用[5]。鑒于一些mi RNA基因可以通過調節表觀遺傳機制的，提出了mi RNA的啟動子的甲基化狀態改變，引起mi RNA的異常表達可能是宮頸癌的一種致病機制[6]。 因此，mi RNA在宮頸癌組織中的表達上調或下調，可能在宮頸癌的致病機制中起著致癌基因或者抑癌基因的作用。

1.2mi RNA在宮頸癌中的檢測技術Micro RNA是一種約22個核苷酸長度的內源性RNA堿基對，參與蛋白質的編碼，并引導這些mRNA的轉錄后抑制[7]。目前在宮頸癌研究中，常用于miRNA檢測的方法主要有miRNA分子克隆和測序、RNA 印跡技術、引物延伸基因芯片以及實時定量反轉錄聚合酶鏈反應(q RT-PCR)等。當前宮頸癌研究中應用最廣泛的是借助基因芯片技術進行miRNA 檢測，然后利用q RT-PCR驗證芯片研究的結果。此外，隨著研究技術的發展，原位雜交技術也逐步應用于mi RNA在宮頸癌中的檢測。

1.3mi RNA在宮頸癌發病機制中相關基因的研究Tao Tang[8]等采用TaqMan實時熒光定量聚合酶鏈式反應(RT-PCR)技術，通過聚類分析的方法在宮頸癌的mi RNA表達譜中，發現了2個上調(mi R- 182 and 183 )和9個下調(mi R-211,145,223,150,142-5p,328,195,199b,142-3p)mi RNA，并通過原位雜交、Western blot、流式細胞儀等技術最終篩選出mi RNA-182，并證實了最上調的mi RNA-182在宮頸癌中表達顯著升高，并發現了mi R-182與宮頸癌晚期的表達增加顯著相關，并且mi R-182在宮頸癌細胞系中與細胞凋亡和細胞周期信號通路有關。最終結果表明mi R-182起著致癌作用，其發病機制與破壞宮頸癌細胞增殖有關。蓋紅霞[9]等通過實時熒光定量PCR技術檢測mi R-218的相對表達量，初步探討其表達與宮頸癌發生的關系。結果表明，宮頸癌組織的 mi R-218表達量相對正常宮頸組織有所下降。因此mi R-218表達水平下調與宮頸癌的發生、發展 、轉移和侵襲等有關，為宮頸癌的治療提供了新靶點，并可能作為其治療及預后評價的一個重要參考指標。韋麗婭[10]等通過基因芯片技術篩選出上調基因mi R-205，對miRNA上調表達的HeLa細胞基因的表達譜進行分析，結果發現在mi R-205上調表達的HeLa細胞中有差異表達的基因共 172 條，其中34條上調，138條下調。因此應用基因芯片技術可以有效的篩查出 mi R-205 上調表達后，在宮頸癌細胞株中存在差異表達的基因，并且mi R-205 引發宮頸癌疾病是由多因素多基因共同作用的結果。Y Shen[11]等應用基因芯片技術篩選出異常表達的mi R-375基因，并利用q RT-PCR等技術，最終發現在紫杉醇治療宮頸癌時mi R-375表達升高。因此，mi R-375基因可能作為紫杉醇治療宮頸癌時的有一個有效治療靶點。

2DNA甲基化在宮頸癌致病機制研究中的應用和進展

2.1DNA甲基化概述DNA甲基化是指在DNA甲基化轉移酶的催化下，選擇性的將S-腺苷甲硫氨酸提供的甲基基團結合到Cp G二核苷酸的胞嘧啶上，形成5’-甲基胞嘧啶的過程。其中DNA甲基化主要發生在Cp G二核苷酸位點。甲基化狀態的改變是引起腫瘤發生的一個重要因素，這種變化包括基因組整體甲基化水平的降低和 5'-GC-3'核苷酸島局部甲基化水平的異常升高，導致基因組的不穩定從而誘發細胞癌變。其異常高甲基化所致抑癌基因轉錄失活以及異常低甲基化所致原癌基因激活已經成為腫瘤研究的熱點[12]。

近些年，國內外對宮頸癌的DNA甲基化研究逐漸增多，在宮頸癌研究中發現，有多種基因發生了甲基化，并且這種遺傳學的改變與宮頸癌的發生有很大的關聯性，以下對一些可能與宮頸癌發生、發展密切相關的基因加以總結。(1)上皮型鈣黏素(CDH1、CDH13)基因是一種抑癌基因。上皮型鈣黏素是重要的細胞間黏附分子，其在維持細胞形態和結構完整性上起著重要的作用，其基因的失活則會導致細胞間的黏附力降低，這與腫瘤的浸潤和轉移密切相關。其中CDH1甲基化可能導致E-鈣黏蛋白表達下調或無表達，CDH13則參與細胞黏附和轉移過程，其異常甲基化會引起鈣介導的細胞黏附系統失活，此基因可作為一種潛在的評估發生宮頸癌風險的生物標志物；(2)死亡相關蛋白激酶(DAPK1)[13]是一種促凋亡的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，該基因是一個參與多種細胞死亡相關信號通路相關聯的抑癌基因，此外，其還參與調節細胞自噬。目前也有大量研究發現DAPK1的基因啟動子的變異性高度甲基化的改變，發生在多種腫瘤中。DAPK1 啟動子 Cp G 島甲基化可導致基因的失活，并可能參與宮頸癌的發生和發展；(3)Ras相關區域家族(1A RASSF1A)是一種腫瘤抑制基因，該基因丟失及表達改變與多種癌癥的發病機制相關，可能是通過影響細胞周期發展、促進細胞凋亡及抗微管解聚等發揮抑制腫瘤細胞生長及轉移的作用。由于甲基化的 RASSF1A 基因不能正常表達，從而失去了對細胞的正常生長調節作用，使細胞發生惡變，進而癌變成為惡性腫瘤，是宮頸癌發病機制之一。RASSF1A基因的Cp G島啟動子區域的超甲基化與該基因失活有關，該基因編碼的蛋白與誘導細胞周期阻滯有關；(4)CADM1A是一種位于人類染色體11q23.2中的腫瘤抑制基因，其參與細胞骨架構建和維持細胞的黏附功能的穩定，當CADM1A基因啟動子的變異性高度甲基化時會引起腫瘤轉移和侵襲；(5)維甲酸受體 -β(RAR-β)屬于核轉錄調節劑甲狀腺激素受體超家族中一員，通過調節基因的表達，限制多種類型細胞生長。有關研究表明RAR-β的甲基化程度隨著宮頸病變的嚴重程度而上升；(6)P16INK4a(CDKN2a)基因又稱多瘤抑制因子，是一種參與細胞周期調控的抑癌基因，其編碼的蛋白為CDK4的抑制劑。其產物P16INK4a蛋白通過與細胞周期素D(cyclin D)競爭性地結合周期蛋白依賴性激酶(CDK4和CDK6)，并特異性抑制CDK4和CDK6激酶的活性，阻止細胞由G1期進入S期，抑制細胞過度增殖，從而抑制腫瘤的發展，是細胞周期調控與癌癥關系中最直接聯系的一種腫瘤抑制蛋白。相關研究表明P16INK4a啟動子區甲基化是P16INK4a基因失活的原因之一，且其表達和宮頸癌的發展及預后密切相關；(7)SOX1(性別決定性基因)編碼SOX家族轉錄因子之一，參與調節胚胎發育和決定細胞存亡。有關研究表明，SOX1基因在宮頸癌組織中甲基化頻率高于正常宮頸組織，并且差異有顯著性[14-15]。

2.2DNA甲基化在宮頸癌研究中的檢測方法目前，在宮頸癌研究中，DNA甲基化的檢測方法主要分為三類：基因組整體水平的甲基化檢測、基因特異位點甲基化的檢測和新甲基化位點的尋找。常用的方法主要有甲基化特異性聚合酶鏈反應法(MS-PCR)、亞硫酸氫鈉-限制性酶切法的引物設計、Souther印跡法、實時熒光PCR法、DNA序列法、亞硫酸氫鈉-測序法等[16-17]。

2.3DNA甲基化在宮頸癌發病機制中相關基因的研究姚紅霞[18]等采用甲基化特異性PCR法和免疫組化法檢測正常宮頸組織和宮頸癌組織中p16基因甲基化的發生率以及p16蛋白表達的缺失率，結果發現在正常宮頸組織中沒有檢測到p16基因甲基化，但是在宮頸癌組織中檢測到，并且p16基因的甲基化發生率與宮頸癌的癌變程度成正相關，提示p16基因甲基化與宮頸癌疾病的發生具有相關性。巫劍紅[19]等應用Cp G島富集化分析甲基化芯片(MIRA)技術，從正常組織和宮頸癌組織中篩選出異常表達的甲基化基因，并選取其中甲基化水平較高的性別決定性基因9(SOX9)，接著用亞硫酸氫鈉-限制性酶切法檢測正常宮頸脫落細胞和宮頸癌脫落細胞中的SOX9的甲基化狀態。最終結果表明，SOX9在宮頸癌組織中頻繁發生甲基化，并且其甲基化水平顯著高于正常宮頸組織，因此SOX9可能作為檢測宮頸癌的一種分子標志。張惠嬌[20]等采用甲基化特異性聚合酶鏈式反應(MSP)測定宮頸鱗癌(CSCC組)、宮頸上皮內瘤變(CIN組)和正常宮頸組織(對照組)中的RUNX3基因甲基化的狀態，結果在CSCC組和CIN組中檢測出RUNX3基因啟動子發生了甲基化，而對照組未檢測出，因此RUNX3可作為抑癌基因參與宮頸鱗癌的發生和發展，也可作為對宮頸鱗癌患者進行預后評估的生物學指標。Lin等[21]采用在宮頸癌細胞系中誘導性別決定性基因1(SOX1)過表達，對小白鼠進行體外實驗構建動物模型。結果發現過表達的SOX1可以抑制宮頸癌細胞(HeLa，CaSki)的增殖，其中SOX1可以抑制TCF依賴性轉錄活性和Wnt靶基因，同時還通過調節侵襲相關基因的表達抑制其侵襲。因此SOX1可以通過宮頸癌中Wnt或β-catenin的信號干擾作為腫瘤的一個抑制基因。

3展望

宮頸癌是影響女性生殖器官最為常見的癌癥之一，它在所有癌癥總體中位列第七，在女性癌癥中位居第二。在發展中國家，宮頸癌通常在女性癌癥中最常見，大約占據女性癌癥的25%。相信隨著分子生物學相關技術的快速發展和mi RNA、DNA甲基化等方面基因作用機制的深入研究，基因治療技術的不斷提高，我們將會更清楚地了解宮頸癌的發病原因、致病機制，為宮頸癌的診斷和治療提供新的依據和方法。同時有望對宮頸癌的病程進展和治療愈后在基因和分子水平上作更進一步的深入研究,對宮頸癌早期診斷、早期治療、延長宮頸癌患者的生存時間和提高宮頸癌病人的生活質量具有重要的意義。

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(收稿日期：2014-07-07，修回日期：2014-07-28)◇藥學研究◇

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2015.02.004

通信作者：張詠莉，女，教授，研究方向：中藥材抗腫瘤藥效及分子機制，E-mail：zyl5198@163.com

作者簡介：張懷念，男，碩士研究生

基金項目：廣東省人口計生委科研項目(No 2012334)