南極大磷蝦粉對點帶石斑魚幼魚氟蓄積的影響

黃艷青, 龔洋洋, 陸建學, 高露姣, 黃洪亮

(中國水產科學研究院 東海水產研究所 農業部東海與遠洋漁業資源開發利用重點實驗室, 上海 200090)

氟作為自然界中分布廣泛的一種元素, 主要蓄積于動物的硬組織, 如骨骼、皮、魚鱗、甲殼中, 對生物體的硬組織構建起著重要的作用[1]。而生物體內氟過量也會產生不利反應, 以魚類為例, 魚體中過量的氟會導致魚類產生生長滯緩、死亡率升高、鰓與肝病變、骨組織畸形、生理代謝紊亂等急性與慢性效應[2-4], 魚體對氟的蓄積因種類、試驗環境不同而存在差異。

南極大磷蝦(Euphausia superba)是南極地區一類多年生的海洋浮游甲殼動物, 具有資源量大, 分布廣、營養價值高等特點[5]。南極大磷蝦粉是磷蝦船載加工的產品, 富含多不飽和脂肪酸、蛋白質、氨基酸、維生素、幾丁質、礦物質和微量元素, 可開發作為一種重要的餌料原料和營養源[6-7]。研究表明, 南極大磷蝦粉有望成為水產養殖業中替代魚粉的最佳蛋白源[8-9], 但由于南極大磷蝦具有富集氟的特性[10],其體內高氟水平(1 000~6 000 mg/kg)影響了其在水產養殖中的進一步加工利用[11]。

點帶石斑魚(Epinephelus malabaricus)屬鱸形目(Perciformes)、 科(Serranidae)、石斑魚亞科(Epincphelinae)、石斑魚屬(Epinephelus), 主要分布在熱帶及亞熱帶海區, 具有肉質鮮美、生長速度快、對環境適應能力強的優點, 是中國東南沿海網箱養殖的主要海水種類[12]。

本實驗通過控制飼料中未經脫氟處理的南極大磷蝦粉的添加比例, 使飼料中氟質量分數在歐盟建議的限量值(350 mg/kg)以內, 飼養點帶石斑魚幼魚 100 d, 分析不同采樣時間點時, 各組點帶石斑魚幼魚組織內氟蓄積以及南極大磷蝦水平對其生長的影響, 以期為南極大磷蝦粉在點帶石斑魚養殖中的安全使用提供參考依據, 同時也為開發利用南極大磷蝦生物蛋白資源提供一定的研究依據。

1 材料與方法

1.1 實驗飼料

以“魚健牌”點帶石斑魚專用飼料(不含南極磷蝦粉)的粉料作為基礎飼料, 將南極大磷蝦粉經超微粉碎過60目篩后, 以0, 2%, 4%和6%的質量比例添加入基礎飼料中, 分別加工成4組顆粒飼料, 分別稱為0%組(對照組), 2%組, 4%組和6%組。各組飼料的粒徑大小為4~8 mm, 在飼喂實驗點帶石斑魚幼魚之前, 實驗飼料中添加少量水進行軟化膨脹處理成軟顆粒料, 以利于實驗魚攝食與消化。各組實驗飼料的主要營養成分及飼料中的氟質量分數見表1。

表1 南極大磷蝦粉、實驗飼料的營養組成和氟質量分數Tab.1 The proximate nutritional compositions and fluorine content of experiment diets

1.2 實驗魚飼養管理

實驗魚選用當年培育的同一批次點帶石斑魚幼魚, 經暫養馴化, 能正常攝食顆粒飼料之后, 挑選體格健康、規格相近的點帶石斑魚幼魚(初始體質量為3.50 g±0.30 g, 體長 5.5 cm±0.3 cm)放入室內水泥池(350 cm×450 cm×150 cm)中的直徑為40cm的浮式小網箱中, 每一網箱內放養80 尾, 共12個網箱, 分組投喂0%組(對照組), 2%組, 4%組, 6%組飼料, 每一處理組設3重復。養殖用水經沙濾和黑暗沉淀處理后,微流水養殖, 實驗期間鹽度28~30、水溫24~26℃、溶解氧6 mg/L以上。每天飽食投喂2次(07:30和16:30)并吸污一次, 實驗為期100 d。

1.3 采樣方法

飼養30、60和100 d時, 分別從每個網箱中隨機取 10 尾點帶石斑魚, 經破壞脊髓處死, 用超純水將體表沖洗干凈, 解剖后取肌肉、脊椎骨、皮(含鱗片)、鰓和肝臟, 用超純水清洗, 濾紙吸干, 105 ℃烘至恒質量[13](GB 5009.3-2010), 樣品研碎, –20℃冰箱中保存備用。所用玻璃器皿均經 30 % 稀硝酸浸泡24 h, 用超純水沖洗3次后烘干備用。

1.4 測定指標

氟標準溶液和總離子強度調節緩沖液(TISAB)的配制方法參照國標 GB/T 5009.18-2003[14]。以氟質量分數對數(1ogCF–)為橫坐標, 以電位值(mV)的絕對值為縱坐標, 繪制氟標準曲線圖。測定實驗魚各組織溶液的電位值, 計算試樣中氟質量分數。測定公式:

式中,X為試樣中氟質量分數(mg/kg),m為試樣質量(g),CF–為據電位值查得的濃度。

1.5 特定生長率[15]的測定

特定生長率(Specific growth rate, SGR,%/d)的計算公式如下:

式中,Wt為實驗采樣時魚體質量(g),W0為實驗開始時魚體質量(g),t為飼養天數(d)。

1.6 數據處理

實驗數據采用平均值±標準差(Mean±SD)表示,用 SPSS 18.0統計軟件對各參數作方差分析(ANOVA), 并進行 Duncan氏多重比較, 做差異顯著性分析, 顯著性水平采用0.05,P<0.05表示差異顯著。

2 結果

2.1 飼料中南極大磷蝦粉對點帶石斑魚幼魚組織氟分布的影響

本實驗分別對同一處理組, 不同取樣時間節點的肌肉、脊椎骨、皮(含鱗片)、鰓和肝組織中的氟質量分數進行監測, 結果顯示, 氟在點帶石斑魚幼魚體內的脊椎骨和鰓中分布程度最高, 氟質量分數分別為58.020~114.380 mg/kg和46.029~123.874 mg/kg,其次是皮(含鱗片)(44.127~88.761 mg/kg), 再次是肝(7.654~18.248 mg/kg), 而肌肉中氟質量分數最低(3.352~3.999 mg/kg)(表2)。

表2 南極大磷蝦粉對點帶石斑魚幼魚各組織氟分布和氟蓄積濃度的影響(mg/kg, 干質量)Tab.2 The effect of Antarctic krill powder on fluorine concentration in different tissues of grouper fed four diets (mg/kg, dry matter basis)

比較同一處理組內, 不同取樣時間點之間的結果發現:

2.1.1 肌肉

0%組、2%組、4%組與6%組的氟質量分數在30、60和100 d時間點之間均無顯著性差異。

2.1.2 脊椎骨

0%組的氟質量分數在100 d時顯著高于30和60 d(P<0.05), 2%組、4%組與6%組中, 氟質量分數從大到小的順序均為 100 d>60 d>30 d, 且差異均顯著(P<0.05)。

2.1.3 皮(含鱗片)

0%組中的氟質量分數隨飼養時間發生顯著改變,在30、60和100 d時間點之間均有顯著性差異(P<0.05);2%組中的氟質量分數在100 d時顯著高于30和60 d;4%組和6%組中的氟質量分數在60和100 d時分別顯著高于其在30 d時的氟質量分數(P<0.05)。

2.1.4 鰓

0%組、4%組和6%組的氟質量分數分別在30 d時最低, 其次是60 d, 在100 d時最高, 且差異均顯著(P<0.05)。2%組在30和60 d時無顯著差異, 而100 d時, 氟質量分數顯著高于30和60 d時。

2.1.5 肝

0%組、2%組、4%組與6%組的氟質量分數均隨飼養時間連續而發生顯著變化, 在 30、60和 100 d之間均有顯著性差異(P<0.05), 氟質量分數在30 d時均最低, 其次是60 d時, 最高是100 d時。

2.2 飼料中南極大磷蝦粉水平對點帶石斑魚幼魚組織氟蓄積的影響

本實驗分別在同一取樣時間點, 對不同處理組的肌肉、脊椎骨、皮(含鱗片)、鰓和肝組織中的氟質量分數進行監測, 組織中氟質量分數和飼料中氟質量分數的相關性分析結果表明:

30 d時, 肌肉中氟質量分數與飼料中氟質量分數無相關性, 脊椎骨、鰓、皮(含鱗片)和肝中氟質量分數與飼料中氟質量分數成顯著正相關: 脊椎骨(r=0.883,P=0.000)、鰓(r=0.937,P=0.000)、皮(含鱗片)(r=0.921,P=0.000), 肝(r=0.929,P=0.000)。線性相關的相關系數r值越大, 且為正值, 說明該組織與飼料中氟質量分數的正相關程度越大; 相關系數的概率P<0.05。60 d時, 肌肉中氟質量分數與飼料中氟質量分數無相關性, 脊椎骨、鰓、皮(含鱗片)和肝中氟質量分數與飼料中氟質量分數成顯著正相關: 脊椎骨(r=0.983,P=0.000)、鰓(r=0.899,P=0.000)、皮(含鱗片)(r=0.957,P=0.000), 肝(r=0.863,P=0.000)。

100 d時, 肌肉和肝中氟質量分數與飼料中氟質量分數無相關性, 脊椎骨、鰓和皮(含鱗片)與飼料中氟質量分數成顯著正相關: 脊椎骨(r=0.860,P=0.000)、鰓(r=0.708,P=0.010)、皮(含鱗片)(r=0.863,P=0.000)。

比較同一取樣時間, 不同處理組之間的結果(表2)發現:

2.2.1 肌肉

在投喂飼料后30、60和100 d時, 4個實驗組間的氟質量分數均無顯著差異(P>0.05)。

2.2.2 脊椎骨

30 d時, 4%組與 6%組的氟質量分數顯著高于2%組與 0%組(P<0.05), 而 2%組與 0%組以及 4%組與6%組之間無統計學上的差異(P>0.05); 60 d時, 6%組的氟質量分數最高, 其次是 4%組, 再次是 2%組,最低是 0%組, 組間具有顯著性差異(P<0.05); 100 d時, 6%組和4%組的氟質量分數顯著高于2%組和0%組, 且6%組>4%組(P<0.05)。

2.2.3 皮(含鱗片)

30 d時, 6%組、4%組和2%組的氟質量分數顯著高于0%組, 4%組與6%組、4%組與2%組之間無顯著差異, 但6%組顯著高于2%組; 60 d時, 6%組、4%組和 2%組的皮(含鱗片)中氟質量分數亦顯著高于 0%組, 且4組之間具有顯著性差異(P<0.05), 其中, 6%組>4%組>2%組(P<0.05); 100 d時, 4組的氟質量分數變化趨勢與30 d時一致。

2.2.4 鰓

30 d時, 4%組與6%組點帶石斑魚的氟質量分數無顯著差異(P>0.05), 但兩組均顯著高于 2%組和 0%組,且2%組顯著高于0%組; 60 d時, 4%組與6%組的氟質量分數顯著高于2%組與0%組, 但0%組與2%組, 4%組與6%組之間無統計學上的差異(P>0.05); 100 d時, 6%組的氟質量分數顯著高于 0%組、2組和 4%組(P<0.05), 而0%組、2%組和4%組間無統計學上的顯著差異。

2.2.5 肝

30 d時, 4%組與6%組的氟質量分數顯著高于2%組與0%組(P<0.05), 且6%組>4%組(P<0.05), 而2%組與0%組之間無顯著差異; 60 d時, 4%組與6%組的氟質量分數顯著高于0%組與2%組(P<0.05), 而0%組與2%組間, 4%組與6%組間無顯著差異(P>0.05); 100 d時, 4個組間肝中的氟質量分數均無顯著差異(P>0.05)

2.3 飼料中南極大磷蝦粉水平對點帶石斑魚幼魚生長的影響

以特定生長率為指標評價各組點帶石斑魚幼魚的生長性能(圖1)。30 d時, 4組的SGR無顯著性差異(P>0.05); 60 d時, 6%組和0%組的SGR無顯著差異, 6%組和2%組及4%組的SGR亦無顯著差異(P>0.05), 但2%組和4%組的SGR均顯著高于0%組(P<0.05); 100 d時, 2%組和0%組, 4%組和6%組的SGR均無顯著差異(P>0.05),但4%組和6%組均顯著高于0%組和2%組(P<0.05)。

圖1 不同采樣時間點各實驗組點帶石斑魚幼魚生長性能Fig.1 The growth performance of groupers fed four diets at different sampling time

3 討論與結論

3.1 飼料南極大磷蝦粉對點帶石斑魚幼魚組織氟分布的影響

早期研究指出, 氟主要積累于動物(包括哺乳動物和魚類)的硬組織, 如骨骼、皮、魚鱗、甲殼等[1,16]。本研究通過對點帶石斑魚幼魚肌肉、脊椎骨、皮(含鱗片)、鰓和肝組織中的氟質量分數進行監測發現,南極大磷蝦粉中的氟在點帶石斑魚幼魚組織中的分布程度, 以脊椎骨和鰓中為最高, 其次是皮(含鱗片),再次是肝, 而肌肉中氟質量分數為最低。而且, 通過30、60和100 d的連續監測, 發現脊椎骨、皮(含鱗片)、鰓和肝組織中氟含量隨飼養時間的連續而產生蓄積, 而肌肉氟含量未隨飼養時間的連續而產生蓄積。

魚骨是魚體氟積累的靶器官[17], 將氟蓄積于骨中的方式可能是生物對高氟的一種防御機制, 機體將氟積累在骨中以達到解毒的目的[1]。本實驗中,點帶石斑魚幼魚各組織中, 以脊椎骨氟蓄積程度最高, 這與Moren 等[18]和 Yoshitomi等[19-20]關于魚類攝食南極磷蝦或磷蝦粉后骨骼中氟含量最高的研究結果相一致。

另外, 皮(含鱗片)和鰓組織中的氟質量分數也較高, 原因可能在于皮(含鱗片)樣品中鱗片占有較大的比例, 鱗片屬于外骨骼, 而鰓是軟骨組織, 皮(含鱗片)和鰓組織中較高的氟蓄積與其骨含量有關。石小濤等[21]指出, 氟在西伯利亞鱘(Acipenser baerii)稚魚硬骨和軟骨組織中具有較高的生物蓄積作用。由本研究結果可見, 點帶石斑魚幼魚的脊椎骨、皮(含鱗片)和鰓組織中氟分布情況符合氟在生物體內的分布規律[1,17]。

本研究還發現, 點帶石斑魚幼魚肌肉的氟質量分數為最低, 這與大西洋鮭(Salmo salar)[22-23], 大西洋庸鰈(Hippoglossus hippoglossus)[23]和大西洋真鱈(Gadus morhua)[23], 虹鱒(Oncorhynchus mykiss)[20]中的研究結果相一致, 此結果佐證了在魚類組織內肌肉中所含的氟質量分數為最低。

投喂含磷蝦產品的飼料后, 不同的研究者對魚骨中氟蓄積研究結果存在較大的差異。以磷蝦肉投喂大西洋鮭、大西洋真鱈、虹鱒和大西洋庸鰈, 4種魚骨中的氟含量沒有蓄積[23], 而以磷蝦粉100%替代魚粉的飼料投喂大西洋鮭[24]和以不同比例磷蝦粉替代魚粉的飼料飼喂大菱鲆(Scophthalmus maximus)[25]、虹鱒[20]、黃尾 (Seriola quinqueradiata)[26], 魚骨中則有很明顯的氟蓄積, 這與磷蝦外殼富集氟有關[27-28], 磷蝦粉中含有磷蝦殼, 磷蝦肉內氟含量遠低于殼內氟的含量。

3.2 飼料中南極大磷蝦粉水平對點帶石斑魚幼魚組織氟蓄積的影響

本研究發現, 各組間脊椎骨、鰓和皮(含鱗片)中氟蓄積量分布差異顯著, 與飼料中氟質量分數呈顯著正相關, 隨著飼料中南極大磷蝦水平的提高, 脊椎骨、鰓和皮(含鱗片)中氟質量分數呈現增加趨勢,與大菱鲆[25]和虹鱒[19]的研究結果相一致。Shi等[29]以氟含量為(75.2~1478.3)mg/kg的飼料, 飼養西伯利亞鱘幼魚 12周發現, 隨著飼料氟含量增加, 鱗甲、軟骨、鰓和皮膚中氟含量增大, 而對肌肉無影響。本實驗結果顯示, 各組間肌肉中氟蓄積量均無顯著性差異, 由此可說明, 肌肉中氟含量與飼料中南極大磷蝦粉水平的高低無相關性, 這進一步印證了肌肉并非是攝入的食源氟累積的靶器官, 與西伯利亞鱘[21]和大西洋鮭[22]的研究結論一致。本實驗中, 各組肝中的氟含量隨飼養時間的連續而產生蓄積, 且在30和60 d時, 各組間肝中氟含量與南極大磷蝦粉水平呈正相關, 而在100 d時, 各組間肝中氟含量并沒有顯著性差異, 南極大磷蝦對肝組織的影響及肝對氟離子的代謝機理還有待作進一步研究確證。

3.3 飼料中南極大磷蝦粉水平對點帶石斑魚幼魚生長的影響

Suontama等[30]觀察到, 以南極磷蝦粉替代 40%魚粉制成飼料投喂大西洋鮭, 可提高大西洋鮭的特定生長率, 尤其在前100 d更為明顯。據Tibbetts等[31]報道, 飼料中添加磷蝦粉,可以有效促進大西洋真鱈和大西洋庸鰈的攝食, 提高其攝食率和消化率,而替代比例超過 25%~50%, 并不能提高其生長性能和飼料利用率。Yoshitomi等[19]發現, 30%南極大磷蝦粉替代魚粉組(氟質量分數 444 mg/kg)與對照組(氟質量分數 105 mg/kg)相比, 虹鱒生長受到抑制。Hansen等[24]以去殼磷蝦粉和未去殼的磷蝦粉 100%替代魚粉的飼料, 投喂大西洋鮭 100 d后, 前者(氟質量分數470 mg/kg)飼養的大西洋鮭與對照組無差異, 而后者(氟質量分數640 mg/kg)的大西洋鮭生長受到抑制。

本研究添加的是未經脫氟處理的南極大磷蝦粉,通過調節添加比例, 使各組飼料的氟質量分數均低于中華人民共和國農業行業標準[32]的魚用飼料氟的最高限量標準(350 mg/kg), 屬于安全氟質量分數限量。以不同南極大磷蝦粉水平制成飼料投喂點帶石斑魚幼魚 30 d時, 與對照組相比, 各實驗組特定生長率均無顯著性差異; 飼養 60 d時, 各實驗組特定生長率均有增高的趨勢; 飼養100 d時, 添加4%和6%南極大磷蝦粉的生長性能明顯具有優勢。日本學者Shimizu等[33]在研究真鯛(Pagrusmajor)嗅覺和味覺反應的實驗中發現, 在飼料中添加南極磷蝦粉對真鯛具有特殊的誘食效果。黃艷青等[34]在研究中亦發現, 飼料中添加南極大磷蝦粉, 對于點帶石斑魚幼魚均有促進攝食和降低飼料系數的作用, 陳國階等[35]認為, 氟在適宜的閥值范圍內, 對于生物組織的構建和生物體的生長發育起著重要的作用。本研究表明在飼料中添加 4%~6%南極大磷蝦粉, 對點帶石斑魚幼魚生長具有明顯的促進作用。

盡管南極大磷蝦粉富含誘食及促生長的營養物質, 但如果因此給飼料中引入過高的氟質量分數,對魚類生長將造成抑制作用。鑒于氟質量分數過高會對動物產生毒害作用[36], 當利用南極大磷蝦作為水產養殖飼料原料時, 應注意控制添加量, 或者去除南極大磷蝦的外殼, 通過降低南極大磷蝦中的氟質量分數, 以降低潛在的氟中毒威脅[37]。

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