利拉魯肽對離體大鼠胸主動脈環(huán)的血管舒張效應(yīng)及其機制研究*

李寧，王雄

利拉魯肽對離體大鼠胸主動脈環(huán)的血管舒張效應(yīng)及其機制研究*

李寧，王雄

目的：研究利拉魯肽對離體大鼠胸主動脈環(huán)的血管舒張效應(yīng)及其作用機制。

方法：分離32只SD雄性大鼠的胸主動脈環(huán)，分成去內(nèi)皮組（n=16）和內(nèi)皮完整組（n=16）。采用離體血管環(huán)實驗方法，經(jīng)生物信號采集與分析系統(tǒng)測定血管環(huán)張力的變化，觀察利拉魯肽（1×10-5mol/L）對去甲腎上腺素（1×10-6mol/L）預(yù)收縮的胸主動脈環(huán)的舒張作用。隨后內(nèi)皮完整組又分為左旋硝基精氨酸甲酯干預(yù)亞組（n=8）和格列苯脲干預(yù)亞組（n=8），分別接受一氧化氮合酶抑制劑左旋硝基精氨酸甲酯（1×10-4mol/L）和非特異性ATP敏感性鉀通道（KATP）抑制劑格列苯脲（1×10-5mol/L）的預(yù)處理，預(yù)處理后利拉魯肽分別作用于預(yù)處理過的去甲腎上腺素預(yù)收縮的胸主動脈環(huán)，觀察利拉魯肽對離體大鼠胸主動脈環(huán)作用的影響。

結(jié)果：利拉魯肽對基礎(chǔ)狀態(tài)的胸主動脈環(huán)無作用。去甲腎上腺素預(yù)收縮胸主動脈環(huán)后，當利拉魯肽濃度達到1×10-5mol/L時，利拉魯肽對去內(nèi)皮組和內(nèi)皮完整組胸主動脈環(huán)均有舒張作用，但對內(nèi)皮完整組舒張作用更強，胸主動脈環(huán)最大舒張幅度達17%（P＜0.05），差異有統(tǒng)計學(xué)意義。經(jīng)左旋硝基精氨酸甲酯和格列苯脲預(yù)處理后，左旋硝基精氨酸甲酯干預(yù)亞組利拉魯肽對胸主動脈環(huán)舒張幅度為4%（P＜0.05），與預(yù)處理前相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義。格列苯脲干預(yù)亞組利拉魯肽對胸主動脈環(huán)舒張幅度為14%（P＞0.05），與預(yù)處理前相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)論：利拉魯肽對去甲腎上腺素預(yù)收縮的胸主動脈環(huán)有明顯的舒張作用，其機制與內(nèi)皮細胞一氧化氮合酶有關(guān)。而KATP未能阻斷利拉魯肽的血管舒張作用。

利拉魯肽；胸主動脈環(huán)；血管舒張；內(nèi)皮；一氧化氮合酶；ATP敏感性鉀通道

Methods: The thoracic aortic rings were isolated from 32 male SD rats and divided into 2 groups: Without endothelium group and With intact endothelium group, n=16 in each group. The contractile force of vascular ring was detected and the effect of liraglutide (1×10-5mol/L) on vasodilatation of norepinephrine (NE, 1×10-6mol/L) pre-contracted ring was observed. The aortic ring in With intact endothelium group was further divided into 2 subgroups:①the aortic ring was pre-treated by the inhibitor of nitric oxide synthase (NOS) (L-NAME at 10-4mol/L),②the aortic ring was pre-treated by non-specific ATP-sensitive-potassium (KATP) channel (Glibenclamide at 10-5mol/L), n=8 in each group. The impacts of liraglutide on those 2 sub-groups were studied.

Results: Liraglutide had no effect on isolated aortic ring at basic condition. Liraglutide at (10-5mol/L) had vasodilatation effect in both Without endothelium and With intact endothelium groups, the effect was stronger in With intact endothelium group and the maximum vasodilatation reached 17%, P＜0.05. Ⅰn both pre-treated subgroups, the effect of liraglutide on vasodilatation in sub-group① reached 4%, P＜0.05, and the effect in sub-group②

reached 14%, P＞0.05.

Conclusion: Liraglutide had obvious effect of vasodilatation on NE pre-contracted thoracic aortic ring in experimental rats, the mechanism might be related to NOS, while KATPchannel could not block the vasodilatation effect of liraglutide.

(Chinese Circulation Journal, 2015,30:50.)

控制血糖不僅對糖尿病本身有重要意義，而且對預(yù)防冠心病也同樣重要[1]。期望一種新型的降糖藥物，在控制血糖的同時，可以降低心血管風(fēng)險，減少心血管事件發(fā)生，將給合并糖尿病的冠心病患者帶來極大的益處。美國食品藥品監(jiān)督管理局于2010年批準人胰高血糖素樣肽-1類似物利拉魯肽上市，目前已有臨床應(yīng)用。利拉魯肽可以有效降低2型糖尿病患者的血糖水平，還可改善多種心血管危險因素，且有輕微的血管擴張作用，對心血管系統(tǒng)起到保護作用，合并糖尿病的心血管疾病患者獲益更多[2-13]，但其潛在的心血管保護作用機制尚未闡明。本實驗旨在探討利拉魯肽對離體大鼠胸主動脈環(huán)的血管舒張效應(yīng)及其機制。

1 材料與方法

實驗動物與分組：在2013-06至2013-09期間研究納入32只SD雄性大鼠，平均體重（250±20）g，購于中國食品藥品檢定研究院。分為內(nèi)皮完整組（n=16）和去內(nèi)皮組（n=16）。隨后內(nèi)皮完整組又分為左旋硝基精氨酸甲酯干預(yù)亞組（n=8）接受一氧化氮合酶抑制劑左旋硝基精氨酸甲酯（1×10-4mol/L）的預(yù)處理和格列苯脲干預(yù)亞組（n=8）接受非特異性ATP敏感性鉀通道（KATP）抑制劑格列苯脲（1×10-5mol/L）的預(yù)處理，利拉魯肽分別作用于預(yù)處理過的去甲腎上腺素預(yù)收縮的胸主動脈環(huán)。

試劑與儀器：利拉魯肽（商品名：諾和力，丹麥諾和諾德公司生產(chǎn)），去甲腎上腺素購于天津金耀氨基酸有限公司，乙酰膽堿購于上海乙基化工有限公司，左旋硝基精氨酸甲酯購于上海金穗生物科技有限公司。Krebs-Henseleit（K-H）液（NaCl 118.0 mol/ L，KCl 14.7 mol/L，KH2PO41.2 mol/L，CaCl22.5 mol/L，MgCl21.2 mol/L，NaHCO325.0 mol/L，葡萄糖 11.0 mol/ L，pH=7.4）。BL-420F計算機生物信號記錄分析系統(tǒng)、張力換能器都購自成都泰盟科技有限公司。數(shù)字式超級恒溫浴鍋購自常州國華電器有限公司。

胸主動脈環(huán)制備：迅速游離大鼠胸主動脈，置于4℃的含有95%O2和5%CO2混合氣體預(yù)飽和的K-H液中，剔除血管周圍組織，剪成3～5 mm的血管環(huán)。血管環(huán)用兩根不銹鋼微型掛鉤貫穿血管管腔，下方固定，上方以一細鋼絲連于張力換能器，橫向懸掛在10 ml K-H液的浴槽中，37℃恒溫，持續(xù)通入95% O2和5% CO2混合氣體。其靜息張力調(diào)節(jié)為 2 g，使用BL-420F生物機能實驗系統(tǒng)記錄血管環(huán)張力變化。每20 min換液一次，平衡60 min。以1×10-6mol/L濃度的去甲腎上腺素預(yù)收縮兩次，以誘發(fā)血管環(huán)的最大收縮幅度，如果前后兩次最大收縮幅度差小于5%，認為反應(yīng)性可重復(fù)。待血管穩(wěn)定后，加入1×10-6mol/L濃度的去甲腎上腺素收縮，待胸主動脈環(huán)張力達到坪值（最大舒張幅度）后，加入梯度濃度的乙酰膽堿（1×10-7、1×10-6、1×10-5mol/L），觀察血管的舒張情況，來檢驗血管內(nèi)皮完整性。去內(nèi)皮的實驗，將修剪干凈的胸主動脈環(huán)兩端固定，用與血管內(nèi)徑相適的棉棒從管腔擦過，連續(xù)2次。胸主動脈環(huán)懸掛穩(wěn)定1 h后，用1×10-6mol/L濃度的去甲腎上腺素液刺激，胸主動脈環(huán)張力達到坪值后加入乙酰膽堿（1×10-5mol/L），舒張幅度不超過收縮幅度的5%時認為內(nèi)皮去除完全，可進行下一步實驗。

大鼠胸主動脈環(huán)舒張功能測定：檢驗內(nèi)皮完整性后，胸主動脈環(huán)用K-H液清洗3次，至其恢復(fù)基礎(chǔ)張力。然后以去甲腎上腺素1×10-6mol/L濃度誘發(fā)胸主動脈環(huán)最大程度收縮，按梯度濃度（1×10-8、1×10-7、1×10-6、1×10-5mol/L）加入利拉魯肽后觀察血管舒張情況，以加入利拉魯肽后的血管張力幅度與去甲腎上腺素誘發(fā)最大收縮幅度之間的張力差反映血管張力的變化。

2 結(jié)果

2.1 利拉魯肽對基礎(chǔ)狀態(tài)下胸主動脈環(huán)的作用

與在基礎(chǔ)狀態(tài)下未加利拉魯肽時比，各濃度（1×10-8、1×10-7、1×10-6、1×10-5mol/L）的利拉魯肽對去內(nèi)皮組和內(nèi)皮完整組大鼠的胸主動脈環(huán)張力均無明顯作用（P＞0.05），差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2 利拉魯肽對去甲腎上腺素預(yù)收縮胸主動脈環(huán)的作用

當利拉魯肽濃度達到1×10-5mol/L時，利拉魯肽對去內(nèi)皮組和內(nèi)皮完整組均有舒張作用，但對內(nèi)皮完整組舒張作用更強，胸主動脈環(huán)最大舒張幅度達17%（P＜0.05）。圖1

圖1 各濃度利拉魯肽對去甲腎上腺素預(yù)收縮的離體大鼠胸主動脈環(huán)的血管舒張效應(yīng)比較

2.3 利拉魯肽對預(yù)處理的去甲腎上腺素誘導(dǎo)收縮的胸主動脈環(huán)的舒張作用

未經(jīng)左旋硝基精氨酸甲酯和格列苯脲預(yù)處理時，利拉魯肽1×10-5mol/L對胸主動脈環(huán)血管的最大舒張幅度為17%，預(yù)處理后，左旋硝基精氨酸甲酯干預(yù)亞組利拉魯肽對胸主動脈環(huán)血管舒張幅度為4%（P＜0.05），與預(yù)處理前相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義。格列苯脲干預(yù)亞組利拉魯肽對胸主動脈環(huán)血管舒張幅度為14%（P＞0.05），與預(yù)處理前相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。可見左旋硝基精氨酸甲酯預(yù)處理對利拉魯肽的血管舒張效應(yīng)有明顯的抑制作用，利拉魯肽是通過一氧化氮途徑舒張血管環(huán)，而格列苯脲預(yù)處理對利拉魯肽的血管舒張效應(yīng)無明顯影響。

3 討論

本實驗結(jié)果顯示，利拉魯肽在1×10-5mol/L濃度時對去甲腎上腺素預(yù)收縮的血管環(huán)有明顯的舒張作用。利拉魯肽原濃度為1×10-3mol/L，實驗用藥濃度僅為原藥的百分之一，說明利拉魯肽在臨床應(yīng)用中可能對血管的有微弱的舒張作用。國外已有實驗證明，利拉魯肽對血管的舒張作用可被左旋硝基精氨酸甲酯部分抑制，原因可能與內(nèi)皮細胞一氧化氮途徑有關(guān)[14-16]。在本實驗中，加入一氧化氮合酶抑制劑左旋硝基精氨酸甲酯后，利拉魯肽的血管舒張幅度被抑制了75%，表明利拉魯肽可能通過刺激內(nèi)皮細胞釋放一氧化氮而產(chǎn)生舒張血管作用，該舒張作用是通過血管內(nèi)皮一氧化氮途徑實現(xiàn)。在去內(nèi)皮的血管環(huán)中加入利拉魯肽，發(fā)現(xiàn)其仍具有血管舒張作用，但舒張作用較內(nèi)皮完整組弱，表明除了內(nèi)皮參與外，利拉魯肽還通過其他途徑舒張血管，利拉魯肽對血管的舒張作用只是部分依賴于內(nèi)皮細胞。國外亦報道，胰高血糖素樣肽-1對大鼠股動脈血管環(huán)的舒張作用并不依賴于一氧化氮及血管內(nèi)皮，其機制可能為不同血管部位對利拉魯肽的血管舒張反應(yīng)有所不同[17]。本實驗采用的是大鼠胸主動脈，因而該血管部位的血管舒張作用可能與一氧化氮及血管內(nèi)皮作用有關(guān)。

K+通道在調(diào)節(jié)血管平滑肌舒縮中也具有重要作用。激活血管平滑肌上的K+通道，可引起細胞膜超級化，從而抑制細胞外鈣內(nèi)流，引起血管舒張。研究表明，高血糖素樣肽-1還可以通過硫化二氫、一氧化碳、非特異性ATP敏感性鉀通道以及電壓門控型鉀通道等途徑對血管產(chǎn)生舒張作用[18,19]。本實驗采用非特異性ATP敏感性鉀通道抑制劑格列苯脲未能阻斷利拉魯肽的血管舒張作用，未能顯示非特異性ATP敏感性鉀通道抑制劑與利拉魯肽的血管舒張作用有關(guān)，與文獻報道不符，其可能機制為國外報道采用艾塞那肽，而本實驗采用藥物為利拉魯肽，雖然兩種藥物均為高血糖素樣肽-1類似物，但二者可能在分子結(jié)構(gòu)和藥物作用方面仍存在一定的差別。

總之，利拉魯肽對去甲腎上腺素誘發(fā)的離體大鼠胸主動脈環(huán)收縮具有舒張作用，其舒張作用為部分內(nèi)皮依賴性，舒張機制可能與內(nèi)皮釋放的一氧化氮合酶有關(guān)。KATP通道與利拉魯肽的血管舒張作用無關(guān)。利拉魯肽對去內(nèi)皮胸主動脈環(huán)的舒張作用還有待研究。

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（編輯：許 菁）

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通訊編委 (姓名按漢語拼音字母排序)

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張海澄 張抒揚 趙 紅 趙連成 趙世華 鄭 哲 周建業(yè) 周京敏

朱天剛

Effect and Mechanism of Liraglutide on Vasodilatation of Thoracic Aortic Ring in Experimental Rats

LⅠ Ning, WANG Xiong.
Department of Cardiology, First Affiliated Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan (030001), Shanxi, China

Objective: To investigate the effect and mechanism of liraglutide on vasodilatation of thoracic aortic ring in experimental rats.

Liraglutide; Thoracic aortic ring; Vasodilatation; Endothelium; Nitric oxide synthase; ATP-sensitivepotassium channel

2014-05-29）

山西省回國留學(xué)人員科研資助項目（項目編號2012-050）

030001 山西省太原市， 山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)院 心血管內(nèi)科

李寧 主治醫(yī)生 碩士研究生 研究方向：冠心病的診斷與治療 Email：4026624@163.com 通訊作者：王雄

Email：sxwangxiong@163.com

R54

A

1000-3614（2015）01-0050-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2015.01.014