甲基蓮心堿聯合伊馬替尼對慢性粒細胞白血病原代細胞Akt/p-Akt蛋白表達的影響

何思潤，胡敏，秦群，楊瑞

（中南大學湘雅醫院，湖南 長沙 410008）

·臨床論著·

甲基蓮心堿聯合伊馬替尼對慢性粒細胞白血病原代細胞Akt/p-Akt蛋白表達的影響

何思潤，胡敏，秦群，楊瑞

（中南大學湘雅醫院，湖南 長沙 410008）

目的探討甲基蓮心堿（Nef）聯合伊馬替尼（IM）對慢性粒細胞白血病（CML）原代細胞Akt/p-Akt表達的影響。方法采用Western blot法分別檢測Akt/p-Akt蛋白的表達水平。結果Nef（4μmol）、IM（1μmol）單藥組與Nef（4μmol）+IM（1μmol）聯合用藥組，對CML原代細胞Akt蛋白的表達均無影響（P＞0.05），而p-Akt蛋白表達均降低，且聯合用藥組較單藥組蛋白表達更低（P＜0.05）。結論Nef聯合伊馬替尼能夠降低CML原代細胞p-Akt蛋白表達，可能是甲基蓮心堿增強伊馬替尼對CML原代細胞敏感性的機制之一。

甲基蓮心堿；慢性粒細胞白血病原代細胞；p-Akt；Akt

慢性粒細胞白血病（chronicmyelocytic leukemia，CML）是一種多能造血干細胞的惡性骨髓增殖性疾病，Bcr/abl融合基因是CML發病的分子基礎，伊馬替尼是Bcr/abl的特異性抑制劑[1]。研究發現，甲基蓮心堿（neferine，Nef）聯合伊馬替尼（imatinib，IM）能夠增強K562/G01增殖抑制作用[2]。本實驗研究甲基蓮心堿聯合伊馬替尼對CML原代細胞Akt/p-Akt的表達影響，從中探討甲基蓮心堿聯合伊馬替尼對CML原代細胞敏感性影響的可能機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集中南大學湘雅醫院門診2012年10月-2013年2月初診為慢性粒細胞白血病慢性期患者3例，年齡18～59歲，平均33.75歲；Ph染色體陽性或Bcr/ abl融合基因陽性。

1.2 主要儀器與試劑

伊馬替尼（瑞士諾華公司惠贈），甲基蓮心堿（華中科技大學藥理學實驗室惠贈），1640培基（Gibco/BRL），小牛血清（杭州四季青公司），BCA蛋白分析定量試劑盒（江蘇碧云天生物技術研究所），蛋白分子質量標準（美國Genview公司），兔抗Akt抗體，兔抗p-Akt（ser473）（美國Cell Signaling Technology公司），5×SDS-蛋白上樣緩沖液（江蘇碧云天生物技術研究所）。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養門診收集的骨髓標本在3 h內于無菌操作臺內以密度梯度離心法進行單個核細胞的提取和分離。調整細胞密度為5×106個/ml，于每孔1 600μl細胞懸液接種于6孔板，置于37℃、5%二氧化碳培養箱中孵育4 h后，按分組加入藥物，使終體積為2 000μl，藥物終濃度及實驗分組如下：CML細胞懸液+400μl無藥組；CML細胞懸液+400μl Nef（4μmol）；CML細胞懸液+400μl IM（1μmol）；CML細胞懸液+200μlIM（1μmol）+200μlNef（4μmol）。按上述分組干預細胞后，置37℃、5%二氧化碳培養箱中培養48 h。

1.3.2 抽提蛋白按上述方法處理CML原代細胞經48 h后，每組取1.5 ml，離心棄上清液，經PBS清洗兩遍棄上清液，得細胞沉淀，向其中加入100μl RIPA蛋白裂解液，充分吹打后置冰上20 min，4℃，12 000 r/min，離心10 min，吸取上清液，提取蛋白質。

1.3.3 檢測Akt蛋白的表達水平提取各組蛋白質，對其進行蛋白定量和變性，行10%SDS-PAGE電泳，轉至聚偏二氟乙烯（polyviny-lidene fluoride，PVDF）膜，加入含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液封閉；將Akt和p-Akt抗體及內參稀釋后，將目的和內參膜分別放入到Akt、p-Akt和內參的一抗工作液中，4℃孵育過夜；洗膜30 min，將洗好的反應膜轉至對應的已稀釋好的抗兔Akt二抗、抗兔p-Akt抗體及內參工作液中孵育1 h；洗膜30 min。采用ECL試劑盒進行顯影（按A∶B按體積比為1∶1充分混合）。

1.4 統計學方法

采用SPSS 18.0統計軟件進行數據分析，實驗數據以均數±標準差（±s）表示，資料符合正態分布且各組方差齊，直接用隨機區組設計資料方差分析，若結果有統計學意義，進一步用LSD-t檢驗作兩兩之間比較；若資料不符合正態分布或方差不齊時，用非參數檢驗的Fridman M檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

將p-Akt和Akt條帶灰度與β-actin的灰度比作為待測蛋白的相對表達量。結果顯示，Nef（4μmol）組、IM（1μmol）組及Nef（4μmol）+IM（1μ mol）組，對Akt蛋白表達均無影響（P＞0.05），而p-Akt蛋白表達均降低，Nef（4μmol）+IM（1μmol）組較IM（1μmol）組更降低p-Akt蛋白表達，差異有統計學意義（P＜0.05）。見附表。

附表 Nef與IM對CML原代細胞Akt總蛋白和p-Akt蛋白表達的影響（n=3±s）

附表 Nef與IM對CML原代細胞Akt總蛋白和p-Akt蛋白表達的影響（n=3±s）

注：1）與Nef（4μmol）組比較，P＜0.01；2）與IM（1μmol）組比較，P＜0.05

組別Akt/actin灰度比值p-Akt/actin灰度比值對照組0.390±0.0380.346±0.023 Nef（4μmol）0.396±0.0480.319±0.032 IM（1μmol）0.389±0.0380.077±0.0151）Nef（4μmol）+IM（1μmol）0.414±0.0690.040±0.0072）

3 討論

慢性粒細胞白血病是由9號染色體的ABL基因易位與22號染色體的BCR融合，形成有酪氨酸激酶活性的BCR-ABL融合基因，進而引起慢性粒細胞白血病[3]。伊馬替尼是第一代酪氨酸激酶抑制劑，通過與BCR-ABL激酶結合，使蛋白穩定在一個非活化構象而發揮功能[4]。國際研究中心（IRIS）研究干擾素和伊馬替尼的臨床試驗結果顯示，伊馬替尼對初診為慢性粒細胞白血病的慢性期患者的療效優于干擾素和阿糖胞苷，是慢性粒細胞白血病的一線治療藥物[5]。

甲基蓮心堿是從睡蓮科植物蓮成熟種子的綠色胚芽中提取的一種雙芐基異喹啉生物堿，具有抗氧化、抗心律失常、抗血小板聚集、擴血管、降壓及化療增敏等藥理作用[6]。研究顯示，甲基蓮心堿在無毒劑量下能增強伊馬替尼對K562/G01細胞的增殖抑制作用[2，7]。

Akt是PI3K/AKT/通路中的關鍵基因，在慢性粒細胞白血病患者中，PI3K/Akt通路被bcr/abl基因持續激活，Akt磷酸化（p-Akt），p-Akt激活下游靶分子，使通道活性增加，影響骨髓基質粘附性，影響細胞增殖以及凋亡，對CML細胞的發生發展起調控作用[8-9]。本研究采用Western blot法檢測Akt/p-Akt蛋白的表達水平，探討甲基蓮心堿聯合伊馬替尼對CML原代細胞影響及可能的增敏機制。實驗結果顯示，甲基蓮心堿聯合伊馬替尼能降低p-Akt蛋白表達，作者推測，甲基蓮心堿可增強伊馬替尼對慢性粒細胞白血病原代細胞的敏感性，可能與降低p-Akt蛋白表達有關。本研究采用的病例標本檢測還較少，還有待進一步研究。

[1]EIRING AM,KHORASHAD JS,MORLEY K,et al.Advances in the treatment of chronic myeloid leukemia[J].BMC Medicine, 2011,9(99):1-6.

[2]QIN Q,CHEN XP,YANG ZS,et al.Neferine increases STI571 chemosensitivity via inhibition of P-gp expression in STI571-resistant K562 cells[J].Leukemia Lymphoma,2011,52(4):694-700.

[3]DEININGER M,BUCHDUNGER E,DRUKER BJ.The development of imatinib as a therapeutic agent for chronic myeloid leukemia[J].Blood,2005,105(7):2640-2653.

[4]PANJARIAN S,LACOB RE,CHEN SG,et al.Structure and dynamic regulation of Abl kinases[J].Biological Chemistry,2013, 288(8):5443-5450.

[5]OBRIEN SG,GUILHOT F,LARSON RA,et al.Imatinib compared with interferon and low-dose cytarabine for newly diagnosed chronic-phase chronic myeloid leukemia[J].N Engl J Med, 2003,348(11):994-1004.

[6]唐小卿,曹建國.甲基蓮心堿的藥理作用[J].中國藥理學通報, 2004,20(1):8-10.

[7]楊周生,秦群,閔慧,等.甲基蓮心堿增強伊馬替尼,多柔比星對K562/G01細胞敏感性的研究[J].中南藥學,2008,6(3):280-282.

[8]STEELMAN LS,POHNERT SC,SHELTON JG,et al.JAK/STAT, Raf/MEK/ERK/,PI3K/Akt and BCR-ABL in cell cycle progression and leukemogenesis[J].Leukemia,2004,18(2):189-218.

[9]CHANGF,LEEJT,NavolanicPM,etal.Involvementof PI3K/Akt pathw ay in cellcycle progression,apoptosis,and neoplastictransformation:atargetforcancerchemotherapy[J]. Leukemia,2003,17(3):590-603.

（張蕾 編輯）

Effect of Neferine combined with Imatinib on Akt/p-Akt protein expression in primary cells of chronic myelogenous leukemia

Si-run HE,Min HU,Qun QIN,Rui YANG
(Xiangya Hospital,Central South University,Changsha,Hunan 410008,P.R.China)

【Objective】To investigate the effect of a combination of Neferine and Imatinib on Akt/p-Akt protein expression in chronic myelogenous leukemia(CML)primary cells.【Methods】Akt/p-Akt protein expression was detected by Western blot.【Results】Neither Neferine(4 μmol),Imatinib(1 μmol)alone nor their combination had influence on the Akt protein expression in CML primary cells(P＞0.05).On the contrary,p-Akt expression was reduced in the three groups,and even lower in the combination group(P＜0.05).【Conclusions】p-Akt protein expression is reduced by the combination of Neferine and Imatinib,which may be one of the mechanisms of Neferine sensitizing CML primary cells to Imatinib.

Neferine；chronic myelogenous leukemia primary cell；p-Akt；Akt

R557.3

A

1005-8982（2015）30-0037-03

2015-04-09

秦群，Tel：0731-84327918；E-mail：qinqun8087@hotmail.com