苜蓿根瘤菌菌株發酵生產工藝優化

張欣，楊旭升，程國立，曹亞彬

（黑龍江省科學院生物肥料研究中心，哈爾濱150086）

苜蓿根瘤菌菌株發酵生產工藝優化

張欣，楊旭升，程國立，曹亞彬

（黑龍江省科學院生物肥料研究中心，哈爾濱150086）

本研究對傳統苜蓿根瘤菌發酵培養基——YMA培養基進行優化，用較為廉價的麩皮替換其中的碳源甘露醇，并添加豆餅粉，以增加氮源，設置不同的添加比例與濃度，根據發酵過程中菌體數量的變化，篩選出較佳的培養基配方：麩皮0.5g+豆餅粉1.0g+K2HPO40.25g+KH2PO40.25g+MgSO40.20g+NaCl0.10g+蒸餾水1 000mL。

苜蓿根瘤菌；發酵；培養基

生物固氮是指通過固氮微生物固氮酶系的催化將空氣中的分子態氮轉化成氨態氮的過程，是地球上氮循環的一個重要組成部分。生物固氮將空氣中的氮氣直接轉化為植物可利用的硝酸鹽或銨鹽，可為植物提供氮素，取材方便、成本低廉，還可降低因施用化肥引起的環境污染，提高土壤肥力［1-3］。近年來，豆科植物與根瘤菌共生固氮受到了專家學者的廣泛關注。對豆科植物根瘤菌的生產工藝進行優化，不僅能夠降低成本、提高產量，同時可大大減少工業合成氮肥的施用量，減輕污染、改良土壤、促進農業可持續發展［4-7］，因此具有重要的經濟、社會和生態效益。

1　材料與方法

1.1供試菌株

苜蓿根瘤菌SM33，由黑龍江省科學院生物肥料研究中心保藏。

1.2培養基

1.2.1YMA液體培養基

甘露醇10.0g+K2HPO40.25g+KH2PO40.25g+ MgSO40.20g+NaCl0.10g+蒸餾水1 000mL，pH值為6.8～7.2。

1.2.2優化培養基

將傳統YMA培養基中的碳源甘露醇替換為廉價麩皮，并添加氮源豆餅粉，設置二者不同比例、不同濃度。共設5個處理：麩皮0.25%+豆餅粉0.5%（處理1）、麩皮0.25%+豆餅粉1.0%（處理2）、麩皮0.5%+豆餅粉0.5%（處理3）、麩皮0.5%+豆餅粉1.0%（處理4）、麩皮1.0%+豆餅粉1.0%（處理5）。

1.3實驗器材

本實驗所用主要器材見表1。

表1　實驗器材Tab.1 Experimental apparatus

1.4實驗方法

1.4.1菌株活化

將保藏的苜蓿根瘤菌菌株接種到YMA固體培養基平板上，在電熱恒溫培養箱28℃條件下培養3d，挑選生長旺盛的菌落進行再培養，純化分離出單一菌落［8］。

1.4.2種子液制備

把活化后的菌株，接種到YMA培養基中，放入空氣浴振蕩器中，28℃條件下振蕩培養。按照平板計數法，測定培養液的活菌數量，使其達到2.0× 109/mL［8］。

1.4.3菌株發酵培養

分別配制YMA液體培養基及5種優化培養基各500mL，分裝于5瓶500mL錐形瓶中，每瓶裝量100mL，向其中各接入2mL種子液，放入空氣浴振蕩器中，28℃、150rad/min條件下振蕩培養。

1.4.4菌株生長狀況測定方法

將各錐形瓶中的發酵液分別在不同時間段取樣，利用革蘭氏染色、常規染色法進行苜蓿根瘤菌生長狀況檢測，血球計數法結合平板稀釋活菌計數法計算苜蓿根瘤菌數量。

2　結果與分析

2.1菌株在傳統YMA液體培養基中的生長狀況

將YMA液體培養基中的發酵液分別在培養后8h、12h、18h、24h、30h、36h、40h取樣，檢測菌體生長狀況并計算菌體數量（取平均值），結果見圖1：

圖1　苜蓿根瘤菌在YMA培養基中的生長Fig.1 The growth of Alfalfa Rhizobium in YMA medium

從圖1可以看出，培養時間在0～36h內，苜蓿根瘤菌菌體數量隨發酵時間的延長呈現上升趨勢，在培養至36h最多，達6.67×108/mL。當培養至40h時，菌體衰亡，數量下降。

2.2菌株在優化培養基中的生長狀況

將5種優化培養基中的發酵液分別在培養后8h、12h、18h、24h、30h、36h、40h取樣，檢測菌體生長狀況并計算菌體數量（取平均值），結果見圖2：

從圖2可以看出，將傳統YMA培養基中的碳源甘露醇替換為廉價麩皮，并添加氮源豆餅粉后，5個處理在各培養時間段內菌體數量均有所增加，其中增量最大的是處理4，即麩皮0.5%+豆餅粉1.0%，在培養至36h時菌體數量最多，達17.45×108/mL。

圖2　苜蓿根瘤菌在不同培養基中的生長Fig.2 The growth of Alfalfa Rhizobia in different culture medium

3　結論

麩皮和豆餅粉價格低廉、取材方便且來源廣泛，而甘露醇等藥品的成本較高，不適合應用于大規模工業生產。本研究將傳統YMA培養基進行優化，將其中的碳源甘露醇以廉價麩皮代替，并添加豆餅粉作為氮源，設置不同添加比例、添加濃度，根據發酵過程中苜蓿根瘤菌菌體數量的變化，得到較佳的培養基配方，即麩皮0.5g+豆餅粉1.0g+K2HPO40.25g+KH2PO40.25g+ MgSO40.20g+NaCl0.10g+蒸餾水1 000mL，利用這一配方，生產出了活菌數達17億/mL以上的苜蓿根瘤菌菌劑，節約了生產成本并達到了促進生長的目的，為實現產業化和大面積推廣應用提供了理論依據。

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［6］寧國贊，李元芳，劉惠琴.我國豆科牧草根瘤菌選育及應用研究的進展（1981～1988年）［J］.中國草地，1989，（03）：68-72．

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Process Optimization of Alfalfa Rhizobium Strains Fermentation

ZHANGXin,YANGXu-sheng,CHENGGuo-li,CAOYa-bin
(Research Center ofBioFertilizer ofHeilongjiangAcademyofSciences,Harbin 150086,China)

This studyoptimized the traditional alfalfa rhizobia fermentation medium-YMA medium,replaced the carbon source ofmannitol with cheaper bran,and added bean cake powder,in order to increase the nitrogen source,set different adding proportion and concentration.According to the changes of the number of bacteria in the fermentation process,the better culture medium formula was selected:bran 0.5g+bean cake powder 1.0g+K2HPO40.25g+KH2PO40.25g+MgSO40.20g+NaCl0.10g+distilled water 1000ml.

Alfalfa Rhizobia;Ferment;Culture medium

Q948

A

1674-8646（2015）09-0044-02

2015-07-01