HPLC法測定清熱暗瘡丸中綠原酸的含量

岳 莉，戚繼紅，沈 偉

(安徽省淮北市食品藥品檢驗中心，安徽淮北 235000)

清熱暗瘡丸是由金銀花、大黃浸膏、穿心蓮浸膏、人工牛黃、蒲公英浸膏、珍珠層粉、山豆根浸膏、甘草、梔子浸膏等九味中藥制成的中藥制劑，具有清熱解毒，涼血散瘀，瀉火通腑之功效，臨床用于治療痤瘡(粉刺)，癤痛。該產(chǎn)品收載于《衛(wèi)生部藥品標準》中藥成方制劑第六冊，原標準沒有有效成分的含量測定。金銀花為其處方中君藥之一，主要成分為綠原酸，具有抗菌、抗病毒活性。為了有效控制該產(chǎn)品的質(zhì)量，經(jīng)參考有關文獻及《中國藥典》2010年版一部［1］方法，本文采用高效液相色譜法測定金銀花中綠原酸的含量，用于本制劑的質(zhì)量控制。

1 儀器及試藥

1.1 儀器 Thermo U-3000 HPLC色譜系統(tǒng);ChromeleonTM7工作站;Thermo DAD-3000檢測器;超聲波處理器(濟寧奧波超聲電氣有限公司，批號:JAC-300);Mettler AE-240電子分析天平(0.1 mg;0.01 mg)。

1.2 試藥 綠原酸對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號:110753-200413，供含量測定用);清熱暗瘡丸，來源:我所監(jiān)督抽樣樣品(吉林省天光藥業(yè)有限 公 司，批 號:20130201，20130204，20130307，20130312);乙腈、磷酸為色譜純;甲醇為分析純，水為重蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗［2－4］色譜柱:十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，Thermo C18(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動相為乙腈—0.4%磷酸溶液(14∶86);流速:1.0 mL·min-1;柱溫:25℃;進樣量:10 μL;檢測波長 327 nm［2］。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品儲備液的制備 精密稱取綠原酸對照品12.78 mg，置50 mL棕色量瓶中，用適量50%乙醇溶解，超聲，冷卻定容，搖勻，即得濃度為255.6 mg·L-1的綠原酸對照品儲備液。見圖1。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品20丸，研細，取細粉約0.54 g(相當于4丸的重量)，精密稱定，置25 mL棕色量瓶中，加入50%乙醇適量，置超聲儀中超聲30 min，放冷至室溫，用50%乙醇稀釋至刻度，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，用0.45μm微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。見圖2。

2.2.3 樣品陰性對照溶液 按清熱暗瘡丸的處方，稱取除金銀花的粉末約0.54 g，按供試品制備方法制備陰性對照溶液。在供試品色譜圖中，與對照品色譜相應的位置上有著相同保留時間的色譜峰，而陰性溶液在此保留時間無色譜峰出現(xiàn)，表明沒有其它成分干擾峰。見圖3。

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關系的考察 分別精密量取對照品儲備液0.5、1、4、10、20、30 mL 置 50 mL 棕色量瓶中，加50%乙醇稀釋至刻度，按上述色譜條件，精密吸取上述對照品溶液及儲備液10μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以對照品的峰面積(A)為縱坐標，對照溶液濃度為橫坐標(mg·L-1)，得綠原酸的線性回歸方程為 Y=0.532 5X-0.077 71(r=0.999 99)，在 2.556 ～ 255.6 mg·L-1的范圍內(nèi)具有良好的線性關系。

2.3.2 檢測限 按信噪比3∶1計，綠原酸的檢出限為 0.051 mg·L-1。

2.3.3 專屬性試驗 精密吸取樣品陰性對照溶液10μL，注入液相色譜儀，結(jié)果表明，陰性對照無干擾。

2.3.4 精密度試驗 精密量取“2.2”項下10 mL對照品溶液，連續(xù)進樣 5次，綠原酸的面積為27.079、27.051、27.037、27.129、27.039，RSD=0.039%，表明儀器精密度良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗 取樣品測定項下的供試品溶液(批號:20130201)，分別在 0、2、4、6、8、10、12、14、18、30 h進樣測試，記錄色譜圖，其峰面積的RSD為0.60%，提示在30 h內(nèi)都可進行相對準確的定量分析。

2.3.6 重復性試驗 取同一批號的樣品(批號:20130201)6份，各測定2次，照樣品測定項下方法測定，計算含量，綠原酸的平均含量為2.088 3 mg·g-1，RSD 為 0.69%，結(jié)果表明方法重復性良好。

2.3.7 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的樣品(批號:20130204)，置25 mL棕色量瓶中，共9份，分成3組，每組分別精密加入含綠原酸51.12 mg·L-1對照品溶液液 4、5、6 mL，照“2.2.2”制備方法得加樣回收率試驗溶液，精密量取10μL注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定，結(jié)果綠原酸平均回收率為99.8%，RSD=0.82%。結(jié)果見表1。

表1 綠原酸加樣回收率

2.4 樣品的測定 取本品3批(批號:20130201，20130307，20130312)，各取2份，精密稱取適量，置25 mL棕色量瓶中，照“2.2.2”制備方法得供試品溶液。精密量取10μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖(見圖2)，用回歸方程計算含量，結(jié)果見表2。

表2 綠原酸樣品測定結(jié)果

3 討論

綠原酸是由咖啡酸與奎尼酸形成的酯，其分子結(jié)構(gòu)中有酯鍵、不飽和雙鍵及多元酚三個不穩(wěn)定部分。由于綠原酸的特殊結(jié)構(gòu)，決定了其可以利用乙醇、丙酮、甲醇等極性溶劑從植物中提取出來，但是由于綠原酸本身的不穩(wěn)定性，提取時不能高溫、強光及長時間加熱。綠原酸的供試液放置于棕色瓶、冰箱(2℃)保存時最為穩(wěn)定。本文經(jīng)過試驗研究及參考相關資料，確定綠原酸的提取溶劑為50%甲醇，超聲時間 30 min 最佳［5-6］。

因供試品含多組分物質(zhì)，圖譜中還有相關色譜峰，而綠原酸屬于有機酸，在HPLC測定時易發(fā)生前沿或拖尾峰，流動相中加入酸可以改善峰形［7-9］。參考藥典，通過調(diào)節(jié)流動相乙腈—0.4%磷酸的比例，綠原酸峰的保留時間約為8.0 min，所有成分全部出峰時間為35 min，柱效高，峰形好，綠原酸與其它相鄰的色譜峰達到完全分離。

［1］國家藥典委員會.中國藥典(一部)［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:205-206.

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