茶多酚對膠原性關節炎大鼠免疫調節作用研究

李 靜，陳永順，梁建梅，蔣建平，賈曉棟

(1.商丘醫學高等專科學校，河南 商丘 476100;2.廣西醫科大學，廣西南寧 530021)

類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以滑膜炎癥、骨骼和軟骨破壞及滑膜組織增殖為特征的自身免疫性疾病，極易致殘，研究顯示，炎性因子、細胞因子和促炎因子等在類風濕性關節炎發病及進展過程中發揮著重要作用，但是現代醫學對其病因及發病機理闡述迄今尚未完全明確［1-4］。RA作為一種臨床常見疾病，可在任何年齡階段發病，以中年女性較多。據統計，在我國類風濕性關節炎患者有近1 000萬［5-6］。本實驗以Ⅱ型膠原乳化劑誘導大鼠類風濕性關節炎模型，通過測量大鼠足趾容積，分析大鼠免疫器官胸腺和脾臟指數，酶聯免疫法檢測大鼠血清促炎因子IL-6、TNF-α的表達水平，分析上述指標與RA的相關性，從免疫的角度探討茶多酚對膠原誘導性關節炎大鼠的治療作用，為其進一步的研究開發提供實驗和理論依據。

1 儀器與試藥

1.1 主要試劑 雞Ⅱ型膠原、弗氏完全佐劑(Sigma公司)，茶多酚(西安瑞林生物，純度≥98%，醫藥食品級)，地塞米松片(河南新鄉常樂制藥公司)，IL-6、TNF-α檢測試劑盒(南京建成生物公司)。

1.2 主要儀器 電子天平JA2003(上海精密儀器廠)，足趾容積測量儀(北京凱云儀有限公司)，酶聯免疫檢測儀(Bio-Rad)。

1.3 實驗動物 SPF級SD大鼠40只，雌雄各半，體重(160±20)g，由商丘醫學高等專科學校實驗動物中心提供(許可證號SQYZ-2014-A05)。

2 方法

2.1 膠原乳化劑的制備 取雞Ⅱ型膠原蛋白10 mg，加入 0.1 mol·L-1醋酸 5 mL，充分溶解，配成 2 g·L-1溶液，4℃過夜，備用。取弗氏完全佐劑5 mL，膠原5 mL溶液混合，制成膠原乳化液，4℃冷藏備用。

2.2 試驗設計

2.2.1 分組 大鼠40只隨機分為4組:空白組(正常空白對照組)、模型組(類風濕性關節炎模型對照組)、地塞米松組(地塞米松對照組)、茶多酚組(茶多酚治療組)。

2.2.2 模型建立及處置 空白組大鼠右后足墊皮內注射生理鹽水0.1 mL，其余各組大鼠注射膠原乳化劑0.1 mL。1周后相同劑量于尾根部皮內注射加強免疫1次。加強免疫后次日，空白組和模型組灌胃等體積蒸餾水，茶多酚治療組大鼠每天灌胃茶多酚200 mg·kg-1，地塞米松對照組每天灌胃地塞米松 2 mg·kg-1，持續 21 d。

2.2.3 觀測項目 分別在治療的第1、7、14、21天測量大鼠體重和使用足跖容積測量儀測量大鼠右后足跖容積，計算足跖腫脹率，腫脹率(%)=致炎前后足跖容積之差/致炎前的足跖容積×100%。

2.3 指標檢測 給藥結束后，測量記錄各組大鼠體重，測量大鼠足趾體積。處死大鼠，取血清，嚴格按照試劑盒的說明，ELISA法檢測大鼠血清IL-6、TNF-α水平;取胸腺和脾臟計算胸腺指數和脾臟指數，臟器指數=臟器重量(mg)/動物體重(g)。

2.4 統計學處理 使用SPSS19.0軟件進行數據處理。觀測資料中的計量數據，以均值±標準差描述之，均行正態性檢驗。多組間的比較為單因素方差分析，組間兩兩比較為LSD法;多組多時點的觀測資料則行兩因素重復測量方差分析;其它計數資料，多組間的比較為整體+分割卡方檢驗。顯著性水準 α =0.05。

3 結果

3.1 大鼠飲食和體重的變化 各組受試大鼠各時點體重數據列于表1。經兩因素重復測量方差分析:整體看組間差異不顯著，時點間的變化、分組和時間的交互作用均有顯著性意義(P＜0.05)。遂繼續進行精細比較，并結合觀測現象來看:空白組大鼠精神好，飲食好，活潑，其余各組大鼠約從造模第5天開始，食欲不振。分別給予地塞米松、茶多酚后，大鼠飲食有改善，體重增長有所加速，在第21天，與模型組大鼠體重比較，差異有統計學意義(P＜0.05)，結果詳見表1。

表1 大鼠體重資料比較(g，n=10，±s)

表1 大鼠體重資料比較(g，n=10，±s)

注:兩因素重復測量方差分析，空白組不加入分析。

A1:茶多酚組 A2:地塞米松組 A3:模型組 A4:空白組T1:1 d 173.5 ±16.9 175.7 ±16.6 174.5 ±14.1 176.5 ±14.2 T2:7 d 182.6 ±19.3 179.1 ±20.4 171.2 ±16.2 183.5 ±17.5 T3:14 d 187.2 ±16.3 189.5 ±13.7 176.7 ±14.3 192.8 ±21.7 T4:21 d 193.2 ±21.7 194.5 ±16.9 180.3 ±14.5 200.2 ±17.3整體分析F，P (HF系數:0.8012)組間比較 0.172，0.843時點間比較 3.207，0.047組 × 時點 9.084，0.000組間比較t，P A1 vs A2 A1 vs A3 A2 vs A3 T1 0.590，0.562 0.439，0.666 0.238，0.815 T2 0.906，0.377 0.804，0.432 2.062，0.054 T3 1.840，0.082 0.489，0.631 1.242，0.230 T4 0.592，0.561 2.198，0.044 2.530，0.021時點比較t，P A1 A2 A3 T2 vs T1 1.386，0.199 1.531，0.160 0.040，0.969 T3 vs T1 1.826，0.101 0.656，0.528 1.017，0.336 T4 vs T1 0.289，0.779 0.983，0.351 2.410，0.039

3.2 茶多酚對大鼠足趾腫脹的影響 各組大鼠足趾腫脹率資料列于表2。顯然，腫脹率最低的為空白組，其次為地塞米松組。經整體+分割卡方檢驗，第14及21天時，茶多酚組、地塞米松組及模型組等3組間的整體差異顯著(P＜0.05)。結合兩兩組間比較及實驗觀測情況來看:空白組足趾無明顯腫脹。模型組大鼠右后足趾腫脹明顯，足墊增厚，活動明顯受限，而地塞米松對照組及茶多酚治療組大鼠右后足踝腫脹明顯減輕、活動能力較模型組大鼠有所增強，見表2。

表2 大鼠足趾腫脹率資料比較/%

3.3 茶多酚對大鼠胸腺、脾臟指數的影響 各組大鼠胸腺、脾臟指數的資料列于表3。經對茶多酚組、地塞米松組及模型組等3個組的資料做單因素方差分析，整體比較均為顯著(P＜0.05)。兩兩比較并結合數據來看:模型組大鼠胸腺、脾臟指數較空白組明顯升高，地塞米松對照組、茶多酚治療組大鼠胸腺、脾臟指數較模型組明顯降低，與模型組比較有顯著差異(P＜0.05)。

表3 大鼠胸腺、脾臟指數比較(n=10)

3.4 茶多酚對大鼠血清促炎因子IL-6、TNF-α水平的影響 各組大鼠血清的促炎因子IL-6、TNF-α水平數據列于表4。亦經單因素方差分析，IL-6、TNF-α兩個指標，茶多酚組、地塞米松組及模型組等3個組間的整體比較，均有顯著性差異(P＜0.05)。各組之間的兩兩比較也多有統計學意義(P＜0.05)。結合數據來看:給藥結束后，地塞米松對照組、茶多酚治療組大鼠血清IL-6、TNF-α水平明顯降低，與模型組比較，有較大的差別，詳見表4。

表4 大鼠血清IL-6、TNF-α水平比較 (n=10，μg·L-1)

4 討論

近年來，化學合成物中發現新藥的命中率明顯降低，創制成本越來越高，研制周期越來越長。以美國FDA為例，1996年和1997年分別批準了120項以上的新藥申請;但2001年批準的新藥申請數量減為66項，2009年為26項，2010年銳減為21項，加之化學合成藥物的毒副作用顯著，使越來越多的新藥研究人員把目光轉向天然活性產物及其衍生物［7-8］。另據 1995 年美國一項統計結果表明［9］，1984年到1995年間，美國使用的藥物中含天然活性產物及其衍生物的比例高達60%。因此，天然活性產物及其衍生物在藥物的研發及改良中將會發揮越來越重要的作用。

綠茶是世界上很熟知的且受人們喜愛的飲品，茶多酚是綠茶中的主要活性成分，是一類含有多羥基酚類化合物的總稱，含量約占茶葉干物質總量的20%～30%。研究表明，茶多酚具有調節免疫、抗氧化、調血脂、抗衰老、抗腫瘤等多種功效，引起廣泛關注［10-14］。

大量研究資料認為，RA是在遺傳背景的基礎上，在環境因素的影響下，免疫系統調節功能紊亂，引起細胞因子失衡所致的炎癥反應性疾病［15-18］。IL-6作為前炎癥細胞因子，介導炎癥反應和免疫反應，在RA患者骨與軟骨破壞中起著重要作用，目前已開發IL-6受體抗體Tocilizumab用于RA的臨床治療。TNF-α是RA發病和維持關節滑膜炎癥的關鍵致炎性因子，可作用于RA關節組織中的滑膜細胞、巨噬細胞、軟骨細胞和破骨細胞，使這些細胞活化產生金屬蛋白酶、膠原酶等，導致滑膜炎癥反應和血管翳形成，引起骨和軟骨破壞［19-20］。本研究結果顯示，茶多酚200 mg·kg-1每天給類風濕性關節炎(CIA)大鼠灌胃，可增加大鼠飲食，大鼠體重增長明顯加快，與模型組比較P＜0.05;大鼠在給予茶多酚治療后，足跖腫脹明顯減輕，大鼠活動量明顯增加，說明茶多酚對CIA大鼠有一定治療作用。胸腺和脾臟是免疫系統的兩大重要臟器，測定大鼠臟器指數顯示，茶多酚可明顯降低CIA大鼠胸腺、脾臟指數(P＜0.05)，進一步檢測大鼠血清促炎因子IL-6、TNF-α水平顯示，茶多酚治療組明顯低于模型組(P＜0.05)，說明茶多酚對CIA大鼠紊亂的免疫系統有一定的抑制作用，推測其機理可能與調節機體免疫細胞活性、抑制機體免疫細胞過度分泌IL-6、TNF-α引起炎癥反應有關，這為深入研究茶多酚治療RA提供了新的思路。

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