參術活血顆粒中揮發油β-環糊精包合物制備工藝研究

吳電彩，汪海斌，馬 玲，張 毅，陳師農，孫 備，黃順旺，，宋少江

(1.安徽中醫藥大學，安徽合肥 230031;2.安徽省藥物研究所·安徽省中藥研究與開發重點實驗室，安徽合肥 230022;3.沈陽藥科大學中藥學院，遼寧 沈陽 110016)

參術活血顆粒來源于醫院臨床驗方，應用臨床多年，具有益氣健脾，活血散結的功效，主治氣滯血瘀型子宮肌瘤。處方有十味藥材組成，其中莪術、當歸等四味藥材均含有揮發油成分，具有活血、行氣、止痛等作用［1］，與本制劑的功效相符。為最大限度的提取揮發油和增加揮發油在制劑中的穩定性，我們對參術活血顆粒處方中的莪術、當歸等四味藥材的揮發油提取和包合工藝進行了研究。

1 儀器與試藥

AR1140型電子天平(上海加惠儀器儀表有限公司)，揮發油測定器，DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(陜西太康生物科技有限公司)，JJ-2高速組織搗碎機(江蘇金壇市億通電子有限公司)，冷凍干燥機(上海比朗儀器有限公司)，真空干燥箱(上海越眾儀器設備有限公司)，KQ-250E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);藥材均購自合肥市樂家老鋪中藥飲片有限公司，經鑒定符合《中國藥典》2010年版規定，β-環糊精純度大于99%(上海化學試劑站中心化工廠)，硅膠G板(5 cm×10 cm，薄層層析用，青島海洋化工分廠)，其他所用試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 單因素法優選揮發油提取工藝

2.1.1 揮發油加水量的考察 按處方量配比稱取莪術、當歸等四味味藥材3份，每份340 g，置揮發油提取器中，分別加入規定量水(見表1)，浸泡12 h，按《中國藥典》2010年版一部附錄揮發油測定法提取揮發油，從水微沸開始記錄不同加水量所得揮發油量(mL)，提取6 h，以揮發油總量為指標，考察不同加水量對揮發油量的影響，結果見表1。

表1 加水量對揮發油提取量的影響

由表1可知，當加水量為藥材重量的8倍時，揮發油提取總量最高，故選擇加8倍量水提取揮發油。

2.1.2 揮發油提取時間考察 根據預實驗結果，按處方量配比稱取莪術、當歸等四味味藥材2份，每份340 g，分別加入8倍量水浸泡12 h，提取揮發油6 h，以揮發油總量為指標，記錄不同時間的揮發油總量，結果見表2。

表2 提油時間對揮發油提取量的影響/mL

由表2可知，5 h后，揮發油總量基本不再增加，因此提取揮發油時間選擇5 h。因此揮發油提取最佳工藝為:加8倍量水，提取5 h。

2.1.3 揮發油提取驗證試驗 按處方量配比稱取莪術、當歸等四味藥材3份，每份340 g，加8倍量水，用揮發油提取器分別提取揮發油，提取5 h，記錄揮發油量。結果見表3。

表3 揮發油提取驗證

由表3可知:加8倍量水，揮發油提取5 h較完全，且揮發油得量較穩定。

2.2 揮發油 β-CD 包合工藝研究［2－4］

2.2.1 包合物的制備 按比例取β-CD于具塞錐形瓶中，加蒸餾水100 mL，水浴至所需溫度，振搖使β-CD溶解成飽和溶液。緩慢滴入無水乙醇溶解的揮發油，攪拌至試驗規定時間后，4～10℃冰箱中冷藏24 h，抽濾，并分別用水，石油醚(30～60℃)洗滌包合物(各3次，每次5 mL)，并將濾餅放在冷凍干燥機中冷凍干燥，稱重，即得。

2.2.2 包合物中含油量的測定 將制得的包合物置圓底燒瓶中，加蒸餾水300 mL，連接揮發油提取器，按照2010年版《中國藥典》揮發油測定項下［1］有關操作，提取至揮發油不再增加后，停止加熱，放置1 h后讀取揮發油量，并計算揮發油的含量(%)。

同時進行揮發油空白回收率測定。精密量取揮發油1 mL置圓底燒瓶中，加蒸餾水300 mL，同上法操作，計算空白回收率為80%。再計算揮發油包合率和包合物收率，公式如下。

2.2.3 包合條件的優選 (1)正交試驗設計:根據文獻資料，影響揮發油包合的主要因素為β-CD與揮發油的比例(A)、攪拌時間(B)、包合溫度(C)，每個因素取3個水平，以包合率和包合物收率為指標進行正交試驗，篩選最佳工藝條件。選用L9(34)正交試驗表頭。包合工藝的因素水平見表4。

表4 包合工藝的因素水平

(2)正交試驗結果及分析:L9(34)正交試驗結果見表5，方差分析結果見表6。

直觀分析:由表5可知，以包合率為考察指標時，A3＞A2＞A1，B2＞B3＞B1，C3＞C2＞C1，最佳工藝為A3B2C3。以包合物收率為考察指標時，A2＞A3＞A1，B2＞B3＞B1，C3＞C2＞C1，最佳工藝為A2B2C3。

方差分析:由表6、表7可知，以包合率為評價指標時，A因素、B因素有顯著性意義，C因素無顯著意義，重要性依次為A＞B＞C;以包合物收率為評價指標時，A因素、B因素、C因素均無顯著性意義，重要性依次為A＞B＞C。

綜上所述，考慮到包合率和包合物收率的權重系數，包合率占主要比重，確定最佳包合工藝為A3B2C3，即揮發油與β-CD比例為1∶8，加1.5倍量無水乙醇溶解揮發油，包合溫度60℃，包合時間60 min。

表5 正交試驗結果

表6 包合率方差分析結果表

表7 包合物收率方差分析結果表

2.2.4 包合物驗證試驗 按正交試驗優選的包合工藝方案平行進行3次試驗，投油量2.0 mL，β-CD量16 g，加1.5倍量無水乙醇溶解，經包合后得平均包合率為63.22%，包合物收率為83.92%。證明此工藝合理可行。結果見表8。

表8 包合驗證試驗結果

2.3 包合物質量考察［4－5］

2.3.1 顯微成像法 取含揮發油的包合物與空白包合物(β-CD)各少許，用水裝片置顯微鏡下(放大倍數400倍)觀察。結果:空白包合物為規則的半透明板狀結晶(圖1)，含揮發油的包合物為不規則的粉末狀(圖2)。證明揮發油與β-CD已形成包合物。

2.3.2 薄層色譜法 取揮發油0.5 mL，置10 mL容量瓶中，加無水乙醇至刻度，作為對照品溶液;取β-CD 包合物0.5 g，加石油醚(30 ～60℃)25 mL，超聲提取15 min，濾過，濾液揮干，加無水乙醇1 mL作為供試品溶液;另取β-CD 0.5 g加無水乙醇25 mL，超聲提取15 min，濾過，濾液濃縮至1 mL作為陰性對照品溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2010年版一部附錄VIB)試驗，吸取供試品溶液和陰性對照品溶液各2μL，對照品溶液1μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(30～60℃)—丙酮—乙酸乙酯(93∶5∶2)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%香草醛硫酸溶液，熱風吹至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。陰性對照品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，不顯示斑點(圖3)。

由薄層色譜圖可知，包合后的揮發油與未包合揮發油成分基本一致，本品揮發油經β-CD包合后其成分沒有明顯變化，故包合工藝合理，可行。

3 討論［6－12］

包合物制備方法的選擇:我們采用高速組織搗碎法、β-CD飽和水溶液電動攪拌法和超聲法3種方法對包合物的制備進行比較，結果高速組織攪碎法和飽和水溶液電動攪拌法均有較滿意的包合效果，但考慮到工業化生產設備實際情況，故選擇了飽和水溶液電動攪拌法。

包合物干燥方法的選擇:包合物制備完成后，包合物的干燥方法也是影響包合物質量的主要因素之一。常用的干燥方法有減壓干燥、冷凍干燥、噴霧干燥等，我們采用50℃減壓干燥，冷凍干燥(冷凍溫度-40℃，真空度10 Pa，時間3 h)，比較發現冷凍干燥效果更好，目前冷凍干燥設備已普遍應用于藥品生產企業，所以選擇冷凍干燥法。

參術活血顆粒揮發油最佳提取工藝為:加8倍量水，提取5 h;揮發油最佳包合工藝為:取揮發油與 β-CD 比例為1∶8(mL∶g)，包合時間 60 min，包合溫度為60℃。此方法簡單，設備要求不高，適合工業化大生產。揮發油經β-CD包合后，經顯微成像法和薄層色譜法鑒別，結果發現形成新的物象，包合前后揮發油成分基本一致。

β-CD包合技術為中藥新藥研究常用的新技術。本制劑中的揮發性成分采用β-CD包合，有效避免揮發油有效成分損失及貯藏中的不穩定，增加了水溶性，減少了異味和刺激性，提高了藥物的穩定性和有效性。

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