竹鹽釀造醬油對H2O2誘發LLC-PK1細胞氧化損傷的保護作用

宋家樂，李貴節，趙 欣，*

（1.桂林醫學院公共衛生學院，食品衛生與營養學教研室，廣西 桂林 541004；2.重慶第二師范學院，功能性生態食品研究所，重慶 400067；3.重慶第二師范學院生物與化學工程系，重慶 400067）

竹鹽釀造醬油對H2O2誘發LLC-PK1細胞氧化損傷的保護作用

宋家樂1，2，李貴節2，3，趙 欣2，3，*

（1.桂林醫學院公共衛生學院，食品衛生與營養學教研室，廣西 桂林 541004；2.重慶第二師范學院，功能性生態食品研究所，重慶 400067；3.重慶第二師范學院生物與化學工程系，重慶 400067）

目的：研究竹鹽釀造醬油乙醇提取物對H2O2誘發豬腎近曲上皮小管細胞（pig proximal tubular cell）LLC-PK1氧化損傷的保護作用。方法：以不同質量濃度（10～200 μg/mL）的竹鹽釀造醬油乙醇提取物預培養LLC-PK1細胞24 h后，換用含500 μmol/L H2O2的DMEM細胞培養液繼續培養4 h建立細胞氧化損傷模型。四甲基偶氮唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法檢測細胞生存率，硫代巴比妥酸比色法測定細胞內丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量，比色法測定細胞內過氧化氫酶（catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活性和谷胱甘肽（glutathione，GSH）含量。結果：經不同質量濃度竹鹽釀造醬油乙醇提取物預處理24 h后，受損細胞的生存率上升，細胞內MDA生成量減少，ROS水平顯著降低。同時，細胞內抗氧化酶（CAT、SOD和GSH-Px）的活性及其mRNA轉錄水平，GSH含量也較未經竹鹽釀造醬油乙醇提取物處理的受損細胞增加。結論：竹鹽釀造醬油乙醇提取物可以通過提高細胞內抗氧化酶系的活性和抗氧化物質GSH的含量而有效地對抗H2O2誘發的LLC-PK1細胞氧化損傷。

竹鹽釀造醬油；氧化損傷；抗氧化；LLC-PK1細胞

自由基和活性氧（reactive oxygen species，ROS），例如超氧陰離子（O2—）、過氧根離子（O22—）、羥自由基（?OH）、過氧化氫（H2O2）和過氧亞硝酸根（ONOO—）是生物體在進行有氧呼吸時所產生的一類代謝副產物。體內蓄積過多的ROS能引起細胞或組織發生氧化應激反應，特別是其誘發的腎臟上皮細胞氧化損傷，被認為是導致腎臟疾患的重要致病因素之一[1]。特別值得注意的是，在諸多ROS中，H2O2能夠較容易地穿過細胞膜進入細胞內部，誘發細胞膜內多聚不飽和脂肪酸發生脂質過氧化反應，進而引起腎臟細胞損傷，最后導致整個腎臟組織壞死[1-3]。正常生理狀態下，機體內部存在內源性抗氧化系統，包含過氧化氫酶（catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）以及非酶性的谷胱甘肽（glutathione，GSH）。內源性抗氧化物質能幫助清除體內過多的自由基和活性氧，以此緩解氧化應激所造成的損傷。此外，攝取含有豐富抗氧化物質的食品也有助于提升機體自身的抗氧化能力，緩解氧化應激對腎臟機能所造成的不良影響[4-5]。

醬油是以大豆為主要原材料，加入水、豆粕、淀粉、小麥和食鹽等輔料經過制曲、微生物發酵等過程而制成的一種營養豐富且廣受亞洲特別是東亞地區人群所喜愛的傳統發酵調味品。醬油中富含多種人體需要的營養成分如糖類、必需氨基酸、脂肪酸、維生素、煙酸以及鈣、磷等礦物質元素。現代科學研究表明，醬油也是一種具有抗氧化、抗癌、抗炎癥、降血壓等功效的保健食品[6-9]。本實驗利用體外培養LLC-PK1豬腎近曲小管上皮細胞建立H2O2誘導的LLC-PK1上皮細胞氧化損傷模型，探究竹鹽釀造醬油乙醇提取物對H2O2所誘發的豬腎臟上皮細胞氧化應激損傷的保護作用機制，為竹鹽釀造醬油在氧化應激所導致的腎臟疾病的保健預防功能研究方面提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 細胞株、材料與試劑

LLC-PK1豬腎近曲上皮小管細胞購自美國典型微生物菌種保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）。

竹鹽釀造醬油系韓國仁山家竹鹽公司產品。取適量冷凍干燥后的醬油樣品，按1∶10（V/V）比例加入80%乙醇溶液，室溫攪拌提取2～3 h后過濾，重復該過程3 次，合并濾液。濾液經3 600 r/min離心15 min后收集上清液，經50 ℃真空減壓旋轉蒸發后，制備得到醬油乙醇提取物并用二甲基亞砜配成質量濃度為20 mg/mL的儲備液，—20 ℃貯存待用。

DMEM細胞培養液、胎牛血清、四甲基偶氮唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）、2’，7’-二氫二氯熒光黃雙乙酸鈉（2’，7’-dichloro-dihydro-fluorescein diacetate，DCFH-DA） 美國Sigma公司；Trizol試劑、OligodT18、RNase、dNTP、MLV逆轉錄酶 美國Invitrogen公司；SOD測定試劑盒、CAT測定試劑盒、GSH-Px測定試劑盒、GSH測定試劑盒 南京建成生物工程研究所；其余試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

EYELA N-1001S旋轉蒸發儀 日本東京理化器械株式會社；Thermo 3110二氧化碳細胞培養箱 美國Thermo公司；Combi-514R冷凍離心機 韓國Hanil株式會社；Bio-Rad 680酶標儀、Bio-Rad小型水平電泳槽美國Bio-Rad公司；ABI 2720 PCR儀 美國Applied Biosystems公司；FLUOstar OPTIMA熒光酶標儀 德國BMG公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養及分組

LLC-PK1細胞以含有10%胎牛血清的DMEM細胞培養液放置于37 ℃、5% CO2環境下濕化培養，每2～3 d換液。分組時細胞按1×104、2×105個/孔分別接種于96 孔和6 孔細胞培養板中。待貼壁后，用含H2O2（500 μmol/L）的DMEM培養液繼續培養4 h，制備氧化損傷細胞模型。LLC-PK1氧化損傷模型細胞分別按1×104個/孔，每孔100 μL接種于96孔板，細胞貼壁后，以不同質量濃度（10、50、100 μg/mL）的竹鹽釀造醬油乙醇提取物（extract from bamboo salt sauce，BSSE）培養24 h后，進行后續實驗測定。未經過任何處理的正常LLC-PK1細胞作為正常組。

1.3.2 MTT法測定細胞存活率

LLC-PK1細胞按照1.3.1節方法處理后，棄孔內培基并加入100 μL MTT溶液（終質量濃度 0.5 mg/mL）繼續培養4 h。培養結束后棄上清液，每孔加100 μL二甲基亞砜避光振蕩30 min，測定OD490nm后按公式（1）計算細胞生存率。

1.3.3 細胞內MDA生成量的測定

細胞接種于6 孔板，依1.3.1節方法處理后，硫代巴比妥酸比色法測定細胞內MDA生成量[10]。在5 mL玻璃試管中加入500 μL細胞裂解上清液、400 μL 15%的三氯乙酸與0.67%硫代巴比妥酸混合溶液（內含0.01% 2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚），充分混勻并在95 ℃水浴中保溫20 min。待冷卻后，加入3 mL的異丙醇提取色素并測定OD532nm，細胞總蛋白含量以Bio-Rad蛋白質試劑盒定量。按照公式（2）計算MDA生成量。

1.3.4 細胞內ROS生成量的測定

在6 孔細胞培養板中按一定濃度接種細胞并依1.3.1節方法處理，加入含DCFH-DA（20 μmol/L）的DMEM培養液37 ℃孵育20 min，隨后用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗2 次，用FLUOstar OPTIMA熒光酶標儀測定熒光強度，激發波長為485 nm，發射波長為530 nm，按照公式（3）計算相對ROS含量。

1.3.5 細胞內抗氧化酶活力和GSH含量的測定

細胞按2×105個/孔接種于6 孔板，依1.3.1節所述方法處理后，取適量細胞培養上清液按SOD、CAT、GSH-Px和GSH各自的測定試劑盒說明書步驟操作，酶活力以酶比活力單位（U/mg pro）表示，并用細胞總蛋白質含量作校正。

1.3.6 逆轉錄聚合酶鏈式反應（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）法檢測竹鹽釀造醬油乙醇提取物對LLC-PK1細胞相關基因表達的影響

LLC-PK1細胞接種于10 cm細胞培養皿中，依1.3.1節所述方法處理后，使用Trizol試劑照說明書提取細胞內總RNA，紫外法檢測純度后，將各樣品組的總RNA濃度調整至同一水準。各組取等量RNA（2 μg）分別加入OligodT18、RNase、dNTP和MLV酶各1 μL，5×Buffer 10 μL，在20 μL體系下，37 ℃ 120 min，99 ℃ 4 min，4 ℃ 3 min條件下合成cDNA。基因序列逆轉錄后，進行聚合酶鏈式反應。反應條件為95 ℃預變性5 min，58 ℃退火50 s，72 ℃延伸90 s，循環35 次，72 ℃延伸10 min。用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測最終產物的表達程度，并用Image J軟件分析基因表達強度。

1.4 數據分析

2 結果與分析

2.1 竹鹽釀造醬油乙醇提取物對LLC-PK1細胞增殖的影響

采用MTT法觀察10、50、100 μg/mL竹鹽釀造醬油乙醇提取物對LLC-PK1豬腎近曲小管上皮細胞的毒性效應時，3 種質量濃度處理下的細胞生存率均超過80%（結果未顯示），該結果提示竹鹽釀造醬油乙醇提取物對LLC-PK1細胞沒有細胞毒性作用。因此10～100 μg/mL為對細胞無影響的安全質量濃度，并用于后續研究。如圖1所示，與正常組細胞比較，未經竹鹽釀造醬油乙醇提取物預處理的細胞在暴露于H2O2（500 μmol/L）4 h后，生存率明顯下降（P＜0.05）。相反，經不同質量濃度竹鹽釀造醬油乙醇提取物（10～100 μg/mL）預處理24 h后，受損細胞的生存率較損傷模型組（0 μg/mL）細胞明顯增加，且保護效果隨竹鹽釀造醬油乙醇提取物的質量濃度增加而增強，并呈現出顯著的劑量-效應關系（P＜0.05）。該結果提示竹鹽釀造醬油乙醇提取物（10～100 μg/mL）可有效地抑制氧化應激損傷所導致的細胞死亡。

圖1 竹鹽釀造醬油乙醇提取物對LLC-PK1豬腎近曲小管細胞的保護效果Fig.1 Protective effect of ethanol extract from bamboo salt soy sauce on LLC-PK1 renal proximal tubule cells

2.2 竹鹽釀造醬油乙醇提取物對受損LLC-PK1細胞內MDA生成量的影響

圖2 竹鹽釀造醬油乙醇提取物對H2O2致損LLC-PK1細胞內MMDDAA含量的影響Fig.2 Effect of ethanol extract from bamboo salt soy sauce on the level of MDA in LLC-PK1 cells exposed to H2O2

自由基和ROS所誘發的氧化應激損傷可導致細胞膜上的不飽和脂肪酸發生脂質過氧化反應，進而生成對細胞具有毒性作用的脂質過氧化產物MDA，因此MDA可作為衡量氧化應激對細胞造成損傷的指標物質[11]。如圖2所示，經500 μmol/L的H2O2處理后，LLC-PK1細胞內MDA的生成量明顯上升（P＜0.05），在同時給予不同質量濃度竹鹽釀造醬油乙醇提取物（10、50、100 μg/mL）處理后，細胞內MDA生成量呈明顯下降趨勢，且在最高質量濃度100 μg/mL時，呈現出最強的MDA生成抑制能力，這是由于醬油中含有豐富的大豆異黃酮和類黑素等具有強抗氧化能力的活性物質[12-13]，而給予抗氧化劑可以降低H2O2引起腎臟細胞的脂質過氧化程度，防止腎臟細胞發生氧化性損傷[14]。本結果提示竹鹽釀造醬油乙醇提取物能有效地通過降低氧化應激損傷細胞內MDA的生成量而保護細胞。

2.3 竹鹽釀造醬油乙醇提取物對受損LLC-PK1細胞內ROS生成量的影響

機體內部過量生成ROS可造成細胞的氧化應激損傷[15-16]。作為一種重要的ROS，H2O2能較為容易地通過細胞膜進入細胞內并與細胞內的Fe2+通過Fenton反應生成具有高度活性的?OH，進而造成細胞內生物大分子物質諸如DNA、蛋白質和脂類的損傷，導致細胞死亡[17]。如圖3所示，H2O2顯著地提高了受損細胞內ROS水平，加速細胞氧化損傷的進程。相反，經24 h不同質量濃度竹鹽釀造醬油乙醇提取物（10、50、100 μg/mL）預處理后，受損細胞內的ROS水平逐漸降低，且與損傷模型組（0 μg/mL）相比有明顯差異（P＜0.05）。該結果提示竹鹽釀造醬油是一種良好的ROS清除劑。

圖3 竹鹽釀造醬油乙醇提取物對H2O2致損LLC-PK1細胞內ROS含量的影響Fig.3 Effect of ethanol extract from bamboo salt soy sauce on the level of ROS in LLC-PK1 cells exposed to H2O2

2.4 竹鹽釀造醬油乙醇提取物對受損LLC-PK1細胞內CAT、SOD、GSH-Px活力的影響

表1 竹鹽釀造醬油對H2O2致損LLC-PK1細胞內CAT、SOD和GSH-Px活力的影響Table 1 Effect of ethanol extract from bamboo salt soy sauce on the levels of CAT， SOD and GSH-Px in LLC-PK1 cells exposed to H2O2

在正常生理狀態下，內源性抗氧化物質如抗氧化酶（CAT、SOD、GSH-Px）以及非酶性的GSH能有效地對抗氧化應激損傷對機體造成的傷害。SOD可以將細胞內多余的超氧陰離子轉化為H2O2，且生成的H2O2可以被CAT和GSH-Px轉化為無害的水[18]。如表1所示，H2O2能顯著降低細胞內CAT、SOD和GSH-Px等抗氧化酶的活力，加速細胞的氧化損傷。相反，經24 h不同質量濃度竹鹽釀造醬油乙醇提取物（10、50、100 μg/mL）預處理后，受損細胞內的抗氧化酶的活力逐漸升高，與損傷模型組（0 μg/mL）比較有明顯差異（P＜0.05）。此外，添加CAT和SOD有助于防止氧化應激對LLC-PK1細胞所造成的損傷，同時還可以抑制氧化應激所造成的脂質過氧化反應[19-20]。

2.5 竹鹽釀造醬油乙醇提取物對LLC-PK1細胞內GSH含量的影響

GSH作為機體內的一種主要的非酶性抗氧化劑，不僅可以直接通過GSH-Px還原毒性的脂質過氧化物和H2O2，還可以間接地抑制體內自由基的鏈式反應，避免細胞因自由基所導致的損傷[17-18]。如圖5所示，H2O2明顯降低細胞內GSH的含量，而經不同質量濃度竹鹽釀造醬油乙醇提取物（10、50、100 μg/mL）預處理24 h后，受損細胞內GSH的含量逐漸增高，且與損傷模型組（0 μg/mL）比較存在明顯差異（P＜0.05）。

圖4 竹鹽釀造醬油乙醇提取物對H2O2致損LLC-PK1細胞內GSH含量的影響Fig.4 Effect of ethanol extract from bamboo salt soy sauce on the level of GSH in LLC-PK1 cells exposed to H2O2

2.6 竹鹽釀造醬油乙醇提取物對LLC-PK1細胞內CAT、SOD和GSH-Px基因表達水平的影響

圖5 竹鹽釀造醬油乙醇提取物對LLC-PK1細胞內CAT SOD和GSH Px基因表達的影響Fig.5 Effect of ethanol extract from bamboo salt soy sauce on the gene expressions of CAT， SOD and GSH-Px in LLC-PK1 cells

如圖5所示，竹鹽釀造醬油乙醇提取物可有效地增強內源性抗氧化酶CAT、SOD和GSH-Px的基因在LLC-PK1細胞中的表達，從而增強對LLC-PK1細胞氧化應激損傷的保護作用。此外，增強細胞內CAT和GSH-Px的轉錄水平有助于提高細胞內總銅/鋅超氧化物歧化酶（Cu/Zn SOD）和錳過氧化物歧化酶（MnSOD）的活性，進而有效地幫助細胞對抗活性氧造成的氧化應激損傷[16，19-20]。

3 結 論

通過MTT法、硫代巴比妥酸比色法測定細胞內抗氧化標志物水平，采用RT-PCR法對竹鹽釀造醬油乙醇提取物保護H2O2誘發豬腎近曲小管上皮細胞LLC-PK1發生氧化應激損傷的機制研究發現，LLC-PK1細胞暴露于H2O2（500 μmol/L）后，細胞生存率及胞內主要抗氧化酶活力明顯下降，ROS水平及MDA含量明顯上升；預先給予不同質量濃度的竹鹽釀造醬油乙醇提取物處理24 h后，LLC-PK1細胞生存率較未經竹鹽釀造醬油乙醇提取物處理的受損細胞明顯增高（P＜0.05）。作為細胞發生氧化應激損傷后的一種主要生物標志物，MDA是ROS攻擊細胞生物膜內多不飽和脂肪酸后所形成的脂質過氧化物，檢測其生成量可間接反映細胞的受損程度。經不同質量濃度竹鹽釀造醬油乙醇提取物預先保護24 h后，受損細胞內的ROS及MDA含量較未經竹鹽釀造醬油乙醇提取物處理的受損細胞明顯降低。同時，受損細胞內的主要抗氧化酶（CAT、SOD和GSH-Px）活力及非酶性抗氧化物質GSH的含量也得到顯著提升。此外，竹鹽釀造醬油還能上調受損細胞內主要抗氧化酶的mRNA轉錄水平。本實驗為竹鹽釀造醬油作為保健食品緩解自由基引起的細胞氧化應激損傷提供了一定的理論依據，但本實驗結果僅限于細胞水平的體外實驗，對竹鹽釀造醬油在氧化應激損傷下對細胞保護的具體分子生物學機制及其在體內的抗氧化保護機制還有待進一步的深入研究。

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Protective Effect of Bamboo Salt Soy Sauce on H2O2-Induced Cellular Oxidative Damage in LLC-PK1 Cells

SONG Jiale1，2， LI Guijie2，3， ZHAO Xin2，3，*
(1. Department of Food Hygiene and Nutrition， School of Public Health， Guilin Medical University， Guilin 541004， China; 2. Institute of Functional Ecological Food， Chongqing University of Education， Chongqing 400067， China; 3. Department of Biological and Chemical Engineering， Chongqing University of Education， Chongqing 400067， China)

The aim of this study was to investigate the protective effect of ethanol extract from bamboo salt sauce (BSSE) on H2O2-induced oxidative damage in porcine renal epithelial (LLC-PK1) cells. The LLC-PK1 cells were first incubated with different concentrations of BSSE (10-200 μg/mL) for 24 h， and then exposed to H2O2(500 μmol/L) for 4 h. MTT assay was used to evaluate the cell viability. The cellular levels of reactive oxygen species (ROS)， lipid peroxidation， and antioxidant enzymes including catalase (CAT)， superoxide dismutase (SOD)， glutathione peroxidase (GSH-Px) and glutathione (GSH) were measured. In addition， mRNA levels of these antioxidant enzymes were determined by RT-PCR assay. BSSE was able to increase the cell viability， and also decrease the cellular levels of ROS， lipid peroxidation， as well as increase the activity and mRNA expression of antioxidant enzymes when compared with those in control cells. These results suggest that BSSE showed a protective effect against H2O2-induced oxidative damage in LLC-PK1 cells through inhibiting lipid peroxidation，deceasing ROS levels， and increasing antioxidant system activities.

bamboo salt soy sauce; oxidative damage; antioxidant; LLC-PK1 cells

TS201.4

A

1002-6630（2015）09-0176-05

10.7506/spkx1002-6630-201509032

2014-06-24

重慶高校創新團隊建設計劃資助項目（KJTD201325）

宋家樂（1983—），男，講師，博士，研究方向為分子營養學和植物化學。E-mail：biopaul@pusan.ac.kr

*通信作者：趙欣（1981—），男，教授，博士，研究方向為食品營養學和食品化學。E-mail：foods@live.cn