黑米通過上調小腸ABCG5/8和ABCA1基因表達降低膽固醇水平

馬 娜，申婷婷，趙 江，王佳楠，張澤生，王 浩，*

（1.天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津 300457；2.天津科技大學生物工程學院，天津 300457；3.南開大學濱海學院，天津 300270）

黑米通過上調小腸ABCG5/8和ABCA1基因表達降低膽固醇水平

馬 娜1，2，申婷婷2，趙 江1，王佳楠3，張澤生1，王 浩1，*

（1.天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津 300457；2.天津科技大學生物工程學院，天津 300457；3.南開大學濱海學院，天津 300270）

以高脂膳食飼喂致高膽固醇小鼠為動物模型，研究黑米對小鼠血脂水平及小腸膽固醇代謝相關基因調控的影響。將48 只雄性C57BL/6J小鼠隨機分成高脂對照組和3 個實驗組（白米組、黑米低劑量組、黑米高劑量組），測定血清中總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）及高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）水平，氣相色譜法檢測肝臟中膽固醇含量，實時熒光定量聚合酶鏈式反應（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）分析調控小腸膽固醇合成、吸收、轉化及排泄基因HMG-CoA-R、MTP、ABCG5/8、ABCA1、NPC1L1等的mRNA表達水平。結果表明：與高脂對照組相比，白米組小鼠血清中TC、TG、HDL-C含量無統計學差異，但黑米低、高劑量組小鼠血清中TC和TG含量降低，且HDL-C含量顯著或極顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。與高脂對照組相比，白米組小鼠肝臟中膽固醇含量無顯著變化，黑米低劑量組顯著降低（P＜0.05），黑米高劑量組極顯著降低（P＜0.01）。Real-time PCR結果顯示，與高脂對照組相比，黑米低、高劑量組ABCG5/8、ABCA1 mRNA表達水平均極顯著上調（P＜0.01）；黑米低劑量組NPC1L1 mRNA表達水平降低（P＜0.05），黑米高劑量組極顯著降低（P＜0.01）。黑米對高脂膳食飼喂致高膽固醇小鼠膽固醇代謝平衡的調節可能是通過增加小腸中膽固醇的排泄并抑制其吸收實現的。

黑米；小鼠；ABCG5/8；ABCA1；NPC1L1

心腦血管疾病已經成為威脅人類健康的頭號大敵[1]，高血脂癥是引起心腦血管疾病的一個主要原因。因此，通過日常飲食調節對預防和治療心腦血管疾病具有重要意義。

黑米富含花色苷，研究顯示膳食給予黑米花色苷或黑米皮提取物能夠調控機體氧化應激平衡、血脂代謝、炎癥水平等[2-5]。Ling Wenhua等[6-7]報道了膳食黑米和黑米皮不僅可以降低實驗動物的血脂水平、抑制動脈粥樣硬化的發生和發展，還可以降低機體氧化應激水平和提高抗氧化酶活性，并推測該作用與其花色苷類物質有關。

因此，本實驗以高脂喂飼致高膽固醇血癥雄性C57BL/6J小鼠為模型，以添加白米為對照組，研究黑米對小鼠血脂水平及小腸膽固醇代謝相關基因調控的影響，并對其機理進行初步探討，以期為居民健康膳食提供科學指導依據。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

清潔級雄性C57BL/6J小鼠，體質量18～20 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。

黑米（碳水化合物含量78.7%、蛋白質含量9.8%、脂肪含量2.9%、花青素含量1.4%）、白米（碳水化合物含量79.1%、蛋白質含量9.5%、脂肪含量1.1%） 市售。

三甲基硅烷（trimethylsilane，TMS） 美國Supelco公司；TRIzol、SYBR Premix Ex TaqⅡ、cDNA合成試劑盒 寶生物工程（大連）有限公司；總膽固醇（total cholesterol，TC）試劑盒、甘油三酯（triglyceride，TG）試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）試劑盒 中生北控生物科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

Fresco17/21冷凍離心機 美國Thermo公司；UVmini-1240紫外-可見分光光度計 日本島津公司；iCycler實時定量PCR儀、GelDoc XR System凝膠成像系統、電泳儀 美國Bio-Rad公司；安捷倫7890A氣相色譜儀 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 動物分組與飼養

將48 只清潔級雄性C57BL/6J小鼠飼喂普通飼料適應1 周后，根據體質量隨機分成4 組，每組12只，自由攝食飲水。鼠糧配方見表1。記錄小鼠的進食量以及體質量。8 周后斷頸處死小鼠，眼眶取血，離心分離血清，—20 ℃保存待測；分離小鼠內臟，稱質量，—80 ℃保存。

表1 鼠糧成分組成及含量Table 1 Composition and ingredients of the control diet and three experimental diieettssg/kg

1.3.2 小鼠血清血脂水平測定

參照試劑盒說明書提供的方法測定小鼠血清總膽固醇、甘油三酯和高密度脂蛋白膽固醇含量。

1.3.3 肝臟膽固醇含量測定

采用氣相色譜法（gas chromatography，GC）進行肝臟組織中膽固醇含量的測定，具體參見實驗室之前發表論文的方法[8]：肝臟組織經氯仿-甲醇溶液（2∶1，V/V）勻漿后提取不皂化物，N2吹干，TMS衍生化，以豆甾醇為內標利用GC檢測。

1.3.4 小腸膽固醇代謝相關基因mRNA表達水平測定

Trizol法從腸組織中提取總RNA，反轉錄合成cDNA（37 ℃ 15 min；85 ℃ 5 s；4 ℃，終止）。取上述產物進行Real-time PCR擴增（95 ℃預變性30 s；PCR反應：95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40 個循環；溶解步驟），以GAPDH為內參基因。GAPDH：上游5’-G C C T T C C G T G T T C C T A C C-3’，下游5’-CTTCACCACCTTCTTGATGTC-3’；HMG-CoA-R：上游5’-CCAATGGCAACAACGGAAGG-3’，下游5’-GAATCACAAGCACGAGGAAGAC-3’；ABCA1：上游5’-CAGAAGTTGGATGGATTAGATTGG-3’，下游5’-T T G C C T G G T T G G T C T C A T T G-3’；ABCG5：上游5’-GTTCCAAGACTGCTTCTC-3’，下游5’- ATGACTGCCTCTACCTTC-3’；ABCG8：上游5’-TTGGACAACCTGTGGATAG-3’，下游5’-ATAGAGTGGATGCGAGTTC-3’；MTP：上游5’-GCCACATCTGTCACTACCTAC-3’，下游5’-CACCTGCCACTTGCTTCC-3’；NPC1L1：上游5’-CCAACAGGAACAAGAACAAG-3’，下游5’-GACAAGGCTATCACAACTATG-3’。

1.4 數據處理與分析

實驗數據之間比較采用t檢驗，P＜0.05具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 黑米對小鼠血脂水平的影響

圖1 小鼠血清中TC、TG、HDL-C含量的變化Fig.1 Changes in serum TC， TG and HDL-C in mice fed with control diet and three experimental diets

由圖1可知，經過8 周喂養，與高脂對照組和白米組相比，黑米低、高劑量組小鼠血清中的TC、TG含量有降低趨勢（P＞0.05）；與高脂對照組相比，黑米低劑量組HDL-C含量顯著升高（P＜0.05），黑米高劑量組HDL-C含量極顯著升高（P＜0.01）。

黑米富含花色苷，近年來的研究發現，富含花色苷的食物或者食物提取物對于血脂異常有明顯的改善作用，花色苷對血脂的調節作用主要表現在降低TC、TG水平，提高HDL-C水平方面[9]。Xia Min[10]和Ling Wenhua[6-7]等研究發現黑米或黑米皮可以升高載脂蛋白E基因敲除小鼠和兔子HDL-C水平，從而抑制動脈粥樣硬化的發生。本實驗中黑米低、高劑量組小鼠體內HDL-C含量明顯升高（P＜0.05），這與上述文獻[6-7，10]的研究結果一致。

2.2 黑米對小鼠肝臟膽固醇含量的影響

圖2 小鼠肝臟中膽固醇含量的變化Fig.2 Changes in hepatic cholesterol levels in mice fed with control diet and three experimental diets

由圖2可知，與高脂對照組相比，白米組小鼠肝臟中膽固醇含量沒有顯著變化，黑米低劑量組小鼠肝臟中膽固醇含量顯著降低（P＜0.05），黑米高劑量組極顯著降低（P＜0.01）。

2.3 黑米對小鼠小腸中HMG-CoA-R、NPC1L1、ABCG5/8、ABCA1、MTP mRNA表達的影響

圖3 黑米對高脂小鼠小腸HHMMGG-CCooAA-R、NPPCC11LL11、AABBCCAA11、AABBCCGG55/8和MMTTPP mRNA表達水平的影響Fig.3 Effect of three experimental diets added with white rice or black rice at various dosages on mRNA levels of HMG-CoA-R， NPC1L1，ABCA1， ABCG5/8 and MTP in mice fed with a high fat and high cholesterol diet

三磷酸腺苷結合盒轉運體A1（ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1）作為介導細胞膽固醇流出的關鍵轉運體，具有介導細胞內脂質流出，維持細胞脂質穩態的功能，對防止動脈粥樣硬化形成具有重要意義[11-12]。ABCA1的功能是將細胞內的膽固醇轉運到細胞外，再經HDL運送至肝臟代謝形成膽汁酸，從而完成膽固醇代謝。ABCA1途徑在膽固醇流出中有重要地位，研究顯示，過表達ABCA1可以明顯抑制動脈粥樣硬化病變的進程[13]。ABCG5/8（ATP binding cassette transporter subfamily G members 5/8）能夠限制膽固醇在小腸中的吸收，同時把膽固醇排向腸腔。最近的研究表明，ABCG8基因多態性與膽固醇吸收有關，影響膽固醇內穩態[14]。Yu Liqing等[15]研究表明，膽固醇飲食可誘導腸內ABCG5和ABCG8的表達。Real-time PCR結果顯示，與高脂對照組相比，給予黑米膳食可極顯著上調小鼠小腸內ABCA1、ABCG5/8 mRNA的表達（P＜0.01）；NPC1L1（Niemann-pick C1-like 1）蛋白在哺乳動物小腸中大量表達[16]，主要介導小腸從飲食和膽汁中吸收游離的膽固醇進入腸黏膜[17-18]。Altmann等[16]研究發現NPC1L1基因敲除小鼠腸膽固醇吸收水平下降72%。本實驗結果顯示，與高脂對照組相比，黑米低、高劑量組NPC1L1 mRNA表達水平均顯著或極顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），表明小腸中游離膽固醇的吸收極有可能減少；小腸和肝臟是體內膽固醇內源合成的主要器官，細胞通過HMG-CoA還原酶（HMG-CoA-R）催化合成膽固醇，這是膽固醇合成的限速步驟[19-20]，體內研究表明，膽固醇能夠在轉錄水平上調節HMG-CoA-R，不同動物的調節方式可能不同，大鼠主要在翻譯水平調節，而倉鼠和小鼠則表現在轉錄水平上[21-22]，PCR結果顯示，與高脂對照組相比，小腸HMG-CoA-R mRNA表達有下降趨勢（P＞0.05）；微粒體甘油三酯轉運蛋白（microsomal triglycerol transfer protein，MTP）主要參與新合成的載脂蛋白脂化形成新的脂蛋白顆粒[23]，并將合成的脂蛋白轉運到細胞外[24]。結果顯示，與高脂對照組相比，MTP mRNA表達有下降趨勢（P＞0.05）。

3 結 論

膽固醇代謝平衡主要包括以下三方面：膽固醇（食物或膽汁中）的吸收，內源膽固醇的從頭合成以及膽固醇的轉化和外排[25]。膽固醇的吸收主要發生在小腸內，腸道中吸收的膽固醇主要來自于食物、膽汁等，經過小腸的膽固醇約有50%被吸收。本實驗結果表明：與高脂對照組相比，給予黑米膳食后小鼠體內NPC1L1 mRNA表達水平顯著或極顯著降低，ABCA1和ABCG5/8 mRNA表達水平極顯著升高，故黑米對高脂膳食飼喂致高膽固醇小鼠膽固醇代謝平衡的調節，可能是通過增加小腸中膽固醇的排泄并抑制其吸收實現的。

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Black Rice Reduces Cholesterol Level by Upregulating ABCG5/8 and ABCA1 mRNA Expression in Intestines

MA Na1，2， SHEN Tingting2， ZHAO Jiang1， WANG Jianan3， ZHANG Zesheng1， WANG Hao1，*
(1. School of Food Engineering and Biological Technology， Tianjin University of Science and Technology， Tianjin 300457， China; 2. College of Biotechnology， Tianjin University of Science and Technology， Tianjin 300457， China; 3. Binhai College， Nankai University， Tianjin 300270， China)

The influence of black rice on serum lipid (TC， TG， HDL-C) levels and the expression of intestinal cholesterol metabolism-related genes (HMG-CoA-R， MTP， ABCG5/8， ABCA1 and NPC1L1) induced by high fat and high cholesterol diet (HFHC) was investigated in mice. Male mice (n = 48) were divided into four groups. They were fed a HFHC diet alone (C group， n = 12)， or supplemented with 52.6 g/100 g corn starch or with white rice (C+W group， n = 12)，26.3 g/100 g black rice (C+BL group， n = 12) or 52.6 g/100 g black rice (C+BH group， n = 12). After administration for 8 weeks， blood samples were collected for lipid measurements and viscera were removed at the end of the protocol. Serum total cholesterol (TC)， triglyceride (TG) and high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) were assayed by commercial kits. Gas chromatography (GC) was used to determine cholesterol content in hepatic cells. The mRNA expression levels of intestinal HMG-CoA-R， MTP， ABCG5/8， ABCA1 and NPC1L1 were detected by real-time PCR. The contents of serum TC，TG and HDL-C in the experimental groups were similar with those of the control group. However， HDL-C in the black rice groups was significantly elevated when compared with that of the control group (P ＜ 0.05 or P ＜ 0.01). Hepatic cholesterol content were significantly decreased in the C + BL（P ＜ 0.05）and C + BH（P ＜ 0.01）groups when compared with that of the C group. The mRNA expression levels of ABCG5/8 and ABCA1 in intestines were up-regulated by dietary back rice(P ＜ 0.01) when compared with those of the C group. The expression level of NPC1L1 mRNA was downregulated in the C + BL (P ＜ 0.05) and C + BH (P ＜ 0.01) groups. The increase of cholesterol excretion and the inhibition of cholesterol absorption in intestines may explain the mechanisms underlying the hypolipidemic effect of black rice.

black rice; mice; ABCG5/8; ABCA1; NPC1L1

TS201.4

A

1002-6630（2015）09-0136-05

10.7506/spkx1002-6630-201509025

2014-06-11

國家自然科學基金青年科學基金項目（31201322）；“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAD33B05）；天津市高等學校科技發展基金計劃項目（20100609）；天津科技大學大學生實驗室創新基金項目（1314A216）

馬娜（1990—），女，碩士研究生，研究方向為食品營養學。E-mail：nana1191086372@163.com

*通信作者：王浩（1979—），男，副教授，博士，研究方向為食品營養與健康。E-mail：wanghao@tust.edu.cn