腌蝦蛄中優勢乳酸菌的分離篩選與鑒定

劉正行，岳喜慶

（沈陽農業大學食品學院，遼寧 沈陽 110866）

腌蝦蛄中優勢乳酸菌的分離篩選與鑒定

劉正行，岳喜慶*

（沈陽農業大學食品學院，遼寧 沈陽 110866）

從腌蝦蛄中分離49 株疑似乳酸菌株，通過菌株的形態學觀察和生理生化實驗，初步篩選出L14、L22、L28這3 株乳酸菌菌株。再通過16S rDNA序列測定和分析進一步驗證，結果表明，菌株L14與屎腸球菌（Enterococcus faecium）的相似性達到99%，菌株L22與短乳桿菌（Lactobacillus brevis）的相似性達到98%，菌株L28與棒狀乳桿菌扭曲亞種（Lactobacillus coryniformis subsp. torquens）的相似性達到99%。對3 株菌株的生長情況、產酸、耐溫和耐鹽等性能進行測定，結果表明，3 株菌株在24 h內生長情況OD600nm值均超過1.0，測定24 h內菌株產酸pH值均在4.0左右，菌株L22最低可達到pH 3.97，3 株菌株在25～35 ℃之間生長性能良好，均能在食鹽質量濃度為60 g/L的情況下正常生長。

腌蝦蛄；篩選；乳酸菌；16S rDNA

蝦蛄（mantis shrimp）俗稱蝦爬子、螳螂蝦、虎蝦等，隸屬節肢動物門，口足目、蝦蛄科品種，是常見的海產經濟動物[1]。腌蝦蛄是以蝦蛄為主料，以食鹽和其他調味品為輔料腌制而成的一種食品。其口感咸鮮適宜，肉質細嫩爽滑，一直以來深受沿海地帶人們的喜愛，是當地人們餐桌上一道必不可少的美食。在腌蝦蛄生產制作過程中會存在著不同的微生物區系，其中有些優良微生物可以促進產品品質的形成，例如乳酸菌、葡萄球菌、酵母菌等。在短期發酵水產品中，乳酸菌往往更容易成為優勢菌株，其對蝦蛄的作用要遠大于葡萄球菌和酵母菌[2]。因此，本實驗對乳酸菌進行研究。乳酸菌具有改善產品的品質和風味、提高產品質量和穩定性的作用[3]。乳酸菌通過發酵產生有機酸，降低體系pH值，從而抑制腐敗菌和致病菌的生長[4]。乳酸菌還可以促使亞硝酸鹽向一氧化氮肌紅蛋白轉化，減少了腌蝦蛄制品中亞硝酸鹽的殘留量。由此可見，乳酸菌是蝦蛄腌制過程中的關鍵性因素。

目前，對乳酸菌的研究著重于發酵乳制品、泡菜、魚及肉制品加工等方面，羅靚芷等[5]從臭鱖魚中分離出4 株乳酸菌株，陳學云等[4]從鹽干帶魚中分離13 株乳酸菌株，但關于腌蝦蛄中乳酸菌的研究還鮮有報道。從腌蝦蛄中分離乳酸菌，之后再應用于其他的腌制水產品中，最終獲得質量穩定，口感極佳的腌制水產品。這對腌制水產品的工業化生產有著不同的意義。本實驗對腌制蝦蛄中的乳酸菌進行篩選、分離和純化，并對其進行生理生化鑒定及16S rDNA序列比對和分析，以確定其屬種。以期獲得適合用于腌制蝦蛄的乳酸菌菌株，為開發研制出新型發酵劑提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料、培養基與試劑

腌蝦蛄，購于丹東林江名城菜市場。

主要培養基：MRS培養基[6-8]；生理生化鑒定培養基[9-13]：耐鹽性培養基、耐亞硝酸鹽培養基、耐酸性培養基、葡萄糖產酸產氣培養基、石蕊牛奶培養基、產氨培養基、硝酸鹽還原培養基、M.R.培養基、V.P.培養基、明膠液化培養基、產H2S培養基、淀粉水解培養基。

糖醇發酵管[11]、細菌基因組DNA提取試劑盒（離心柱型） 沈陽鼎國生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

SD-JKⅠ型無菌操作臺 蘇凈集團安泰公司制造；手提式不銹鋼蒸汽壓力滅菌鍋 上海申安醫療器械；CT14RD型冷凍離心機、電熱恒溫培養箱 上海精宏實驗設備有限公司；E-201-C型pH計 上海精密儀器有限公司；DYY-8C型穩流穩壓電泳儀 普陽科學儀器研究所；聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的篩選、分離及純化

在無菌操作臺中，準確稱取腌蝦蛄10 g，用醫用手術剪將其剪碎，倒入到盛有90 mL的無菌生理鹽水的錐形瓶中，將其劇烈振動搖晃30 min左右，在室溫下靜置5 min。此樣品液的稀釋度為10—1，取其稀釋液1 mL，連續做6 個梯度稀釋。采用傾注法，每個稀釋度分別吸取0.5 mL稀釋液移置平板中，再加入含有質量分數為3% CaCO3的MRS固體培養基，輕輕搖晃使其混合均勻，冷卻后倒置，于37 ℃條件下培養48 h，每個梯度做3 個平行[14-15]。

挑取有溶鈣圈，顏色為乳白色或淡黃色，直徑大約為1～2 mm大小的單菌落在MRS固體培養基中反復進行劃線（3～4 次左右）培養。將分離純化培養后的菌株，接種到MRS斜面培養基中，并在37 ℃的條件下培養24 h后放置4 ℃的冰箱保藏[7]。

1.3.2 菌株的菌落形態和個體形態學觀察

將菌株進行鏡檢和過氧化氫酶實驗[5]。

1.3.3 生理生化鑒定及菌株的篩選

對疑似乳酸菌菌株分別進行產黏性實驗、耐亞硝酸鹽實驗、硝酸鹽還原性實驗、葡萄糖產氣實驗、運動性實驗、耐高低溫實驗、產H2S實驗、明膠液化實驗、淀粉水解實驗、V.P.實驗、M.R.實驗、產氨實驗、耐酸性實驗、耐鹽性實驗、石蕊牛奶實驗[16]。

1.3.4 基因測序及序列分析

1.3.4.1 DNA的提取

為了進一步驗證生理生化鑒定實驗結果，對疑似乳酸菌株進行16S rDNA測序并分析其序列。按照細菌基因組DNA提取試劑盒中附帶說明書的方法提取菌體中的DNA，之后用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測提取出來的DNA產物。

1.3.4.2 16S rDNA基因序列的聚合酶鏈式反應擴增

對提取出來的DNA基因序列進行PCR擴增，擴增所用引物為細菌通用引物：正向引物為27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，反向引物為1492R：5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’。在1 μL的DNA模板中分別加入正向引物27F和反向引物1492R各1.5 μL，1.0 μL Taq聚合酶（5 U/μL），5.0 μL 10×Buffer（含2.5 mmol/L Mg2＋），超純水39.0 μL，擴增體系的總體積為50 μL[7]。PCR擴增反應過程條件設置為：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，72 ℃終延伸7 min，以上總反應過程需經過45 次循環[17]。PCR的陰性對照基因組DNA用超純無菌水來代替。

將PCR擴增終產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。送北京擎科新業生物技術有限公司測定其16S rDNA序列。得到DNA序列后，登陸（www.ncbi.nlm.gov/ blast/）網站進行序列的比對和序列的同源性分析[19]。進入GenBank數據庫查找與測定菌株親緣關系最近的標準菌株的16S rDNA序列。應用MEGA5.0軟件構建系統發育樹，獲得測定菌株的系統進化位置[18]。

1.3.5 菌株生理性能的測定

1.3.5.1 生長曲線的繪制

將通過生理生化實驗鑒定得到的菌株，分別接種到MRS液體培養基中進行培養。37 ℃培養24 h。每隔4 h用紫外分光光度計在600 nm波長處測定一次光密度（OD）值[19]，并繪制曲線。

1.3.5.2 產酸曲線的繪制

將通過生理生化實驗鑒定得到的菌株，分別接種到MRS液體培養基中進行培養。37 ℃培養24 h。每隔4 h用pH計測定其pH值[20]，并繪制曲線。

1.3.5.3 在不同食鹽質量濃度條件下生長情況的測定

將通過生理生化實驗鑒定得到的菌株，分別接種到含有質量濃度為40、60、80、100、120 g/L的食鹽的MRS液體培養基中進行培養。37 ℃培養24 h。用紫外分光光度在波長為600 nm波長處測定其OD值[21]，并繪制曲線。

1.3.5.4 耐溫性能的測定

將通過生理生化實驗鑒定得到的菌株，分別接種到MRS液體培養基中，在15、25、35、45 ℃的條件下分別培養24 h。用紫外分光光度計在600 nm波長處測定其OD值[22]，并繪制圖表。

2 結果與分析

2.1 菌株的形態學觀察結果

本實驗從腌蝦蛄中分離出49 株疑似乳酸菌菌株，其中有8 株菌株有溶鈣圈，菌落直徑大小在1～2 mm，革蘭氏染色為陽性，過氧化氫酶為陰性。結果見表1。

表1 菌株的形態學觀察結果Table 1 Morphological identification of 8 strains suspected of being lactic acid bacteria

由表1可知，通過形態學觀察篩出的8 株疑似乳酸菌菌株，顏色均為米黃色或乳白色，形狀有球狀或桿狀，排列方式有成團、單個、成鏈等。

2.2 生理生化實驗結果及優良菌株的篩選

將通過菌株形態學觀察篩選出的8 株疑似乳酸菌菌株進行生理生化鑒定實驗，結果如表2所示。篩選出L14、L22、L28這3 株菌株均不產黏性，在含有1 500 mg/L NaNO2培養基中都能正常生長，硝酸鹽還原實驗、石蕊牛奶實驗、M.R.實驗都為陽性，產氨實驗、產H2S實驗、明膠液化實驗、淀粉水解實驗、V.P.實驗都為陰性，葡萄糖不產氣，無運動性，3 株菌株都能耐受60 g/L食鹽并在15、45 ℃和pH 4.5的條件下生長。因此，L14、L22、L28符合食品發酵菌株的要求。再對菌株L4、L22、L28進行糖醇發酵實驗，實驗結果見表3。參考《常見細菌手冊》[12]和《伯杰氏細菌手冊》[13]第八版確定其種屬，菌株L14為屎腸球菌，菌株L22為短乳桿菌，菌株L28為棒狀乳桿菌扭曲亞種。

表2 生理生化實驗鑒定結果Table 2 Results of physiological and biochemical identification

表3 糖醇發酵鑒定結果Table 3 Results of glycolysis identification

2.3 菌株基因組DNA的提取

采用1%的瓊脂糖凝膠電泳對基因組試劑盒提取出的DNA片段進行檢測并在凝膠成像儀下成像，檢測結果見圖1。可以看到條帶清晰，主帶明顯，所有條帶都在同一水平線上。

圖1 菌株基因組DNA檢測電泳圖Fig.1 Electrophoretograms of DNA from three lactic acid bacterial isolates

2.4 16S rDNA基因序列PCR擴增產物及序列對比

PCR擴增后的產物再用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，同時進行PCR陰性對照實驗如圖2所示。在約1 500 bp處有特異性條帶，并且條帶清晰、明顯、單一。因此，16S rDNA基因序列擴增產物滿足測序的要求[23]。

將測定菌株的16S rDNA序列輸入到NCBI（http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）數據庫中，與數據庫中已知菌株的基因序列進行對比。查找與測定菌株親緣關系最近的已知分類地位的標準菌株。比對結果是，菌株L14的16S rDNA序列與屎腸球菌（Enterococcus facium）16S rDNA/RNA序列的相似性最高為99%，菌株L22的16S rDNA序列與短乳桿菌（Lactobacillus brevis）的16S rDNA/RNA序列的相似性最高為98%，菌株L28的16S rDNA序列與棒狀乳桿菌扭曲亞種（Lactobacilluscoryniformis subsp. torquens）的16S rDNA/RNA序列的相似性最高為99%。結果如圖2。

圖2 菌株PCR擴增產物檢測電泳圖Fig.2 Electrophoregrams of the PCR amplification products from three lactic acid bacterial isolates

2.5 系統發育樹的構建

登陸GenBank數據庫，查找與測定菌株親緣關系最近的標準菌株的16S rDNA/RNA序列，使用MEGA 5.0軟件，采用Neighbor-Joining法構建系統發育樹，獲得測定菌株的系統進化地位[24-25]。由圖3可知，L14與屎腸球菌（Enterococcus faecium）的系統位置最接近，L22與短乳桿菌（Lactobacillus brevis）的系統位置最接近，L28與棒狀乳桿菌扭曲亞種（Lactobacillus coryniformis subsp. torquens）的系統位置最接近。因此，根據16S rDNA同源性對比和構建系統發育樹得出結果，菌株L14、L22、L28分別鑒定為屎腸球菌（Enterococcus faecium），短乳桿菌（Lactobacillus brevis）和棒狀乳桿菌扭曲亞種（Lactobacillus coryniformis subsp. torquens）。這與生理生化實驗結果相一致。

圖3 菌株L14、L22、L28的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of three lactic acid bacterial isolates

2.6 菌株生理性能

2.6.1 菌株的生長曲線

圖4 乳酸菌生長曲線Fig.4 Growth curves of three lactic acid bacterial isolates

由圖4可知，L14在0～12 h的時間段，其生長速率明顯高于L22和L28，但在12 h之后，L14到達穩定生長期，菌體密度不會再有太大的變化。L28和L22在0～16 h的時間段中進入對數生長期，在16 h之后都到達穩定生長期。24 h之后，L22和L28的菌體密度明顯高于L14的菌體密度。菌體的生長速率快，繁殖能力強是作為發酵水產品發酵劑的一個重要的衡量標準[22]。

2.6.2 菌株產酸曲線

圖5 乳酸菌的產酸能力Fig.5 Acid-producing capacities of three lactic acid bacterial isolates

由圖5可知，菌株產酸曲線的變化存在一定的相似性，L14、L22、L28在0～16 h時間段中，pH值下降速率最快，而在16 h之后則趨于平緩。這與菌株的生長曲線大體一致。在培養24 h后，3 株菌株的pH值大約都在4.0左右。其中，L22的pH值略低于L14和L28。在蝦蛄腌制過程中，產乳酸速率快，pH值低，被雜菌污染的機率就會有所降低，同時也會有利于風味物質的形成[15]。

2.6.3 菌株在不同溫度條件下的生長情況

圖6 乳酸菌在不同溫度下的生長情況Fig.6 Growth status of three lactic acid bacterial isolates at different temperatures

由圖6可知，3 株菌株在不同的溫度條件下生長情況有所差異，但在25 ℃和35 ℃的條件下生長情況均良好。在35 ℃時生長最旺盛，其中L22和L28的OD600nm值稍高于L14的OD600nm值。而在15 ℃和45 ℃時3 株菌株的生長明顯都受到抑制。

2.6.4 菌株在不同食鹽質量濃度條件下的生長情況

圖7 乳酸菌在不同食鹽質量濃度下的生長情況Fig.7 Growth status of three lactic acid bacteria isolates at different salt concentrations

由圖7可知，隨著培養基中食鹽質量濃度逐漸增加，3 株菌株的生長都不同程度的受到抑制。當食鹽質量濃度在60 g/L時，3 株菌株的生長狀況均良好。當食鹽質量濃度達到120 g/L時，3 株菌株的生長都受到嚴重的抑制，OD600nm值大約都在0.1左右。但L22的耐鹽性明顯好于L28和L14。在腌制蝦蛄過程中，蝦蛄體內的食鹽質量濃度很高，因此需要選用耐鹽性更好的菌株作為發酵劑[16]。

3 結 論

本實驗從腌蝦蛄中分離49 株疑似乳酸菌株，經過形態學觀察，生理生化實驗及16S rDNA序列測定及分析，篩選出3 株乳酸菌株，分別是L14屎腸球菌（Enterococcus faecium）、L22短乳桿菌（Lactobacillus brevis）和L28棒狀乳桿菌扭曲亞種（Lactobacillus coryniformis subsp. torquens）。再對3 株乳酸菌株分別進行產酸、耐溫等相關生理性能的測定。3 株菌株生長性能的OD600nm值都在1.0以上，產酸pH值均下降到4.0左右，溫度在25～35 ℃的范圍內正常生長，低于25 ℃和高于35 ℃時，菌株的生長均受到抑制，食鹽質量濃度在60 g/L時，菌株生長性能良好。3 株菌株均適合作發酵水產品的發酵劑，這為發酵水產品的進一步研究提供參考依據。

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Isolation， Screening and Identification of Lactic Acid Bacteria from Pickled Mantis Shrimp

LIU Zhengxing， YUE Xiqing*
(College of Food Science， Shenyang Agricultural University， Shenyang 110866， China)

Totally 49 strains suspected to be lactic acid bacteria were segregated from pickled mantis shrimp. Three of these strains， namely L14， L22 and L28， were preliminarily screened via morphological observation and physiological and biochemical tests. Subsequent 16S rDNA sequencing and analysis showed that L14 had 99% similarity to Enterococcus faecium， L22 had 98% similarity to Lactobacillus brevis and L28 had 99% similarity to Lactobacillus coryniformis subsp. torquens. The values of optical density at 600 nm (OD600nm) of the three selected strains after 24 h of culture were all higher than 1.0 and the pH values of their cultures were around 4.0 with the lowest pH of 3.97 observed for L22. All these three strains grew well at temperatures ranging from 25 to 35 ℃ and grew normally in the presence of 60 g/L NaCl.

pickled mantis shrimp; screening; lactic acid bacteria; 16S rDNA

TS201.3

A

1002-6630（2015）09-0125-05

10.7506/spkx1002-6630-201509023

2014-07-25

劉正行（1989—），女，碩士，研究方向為功能性食品開發。E-mail：2530367439@qq.com

*通信作者：岳喜慶（1966—），男，教授，博士，研究方向為動物性食品加工。E-mail：yxqsyau@126.com