油橄欖查爾酮合酶與查爾酮異構(gòu)酶基因全長(zhǎng)的克隆及序列分析

陳文拴，黃乾明，*，陳華萍，楊澤身，王安逸，蘇光燦

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，四川 雅安 625014；2.涼山州中澤新技術(shù)開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司，四川 西昌 615000）

油橄欖查爾酮合酶與查爾酮異構(gòu)酶基因全長(zhǎng)的克隆及序列分析

陳文拴1，黃乾明1，*，陳華萍1，楊澤身2，王安逸2，蘇光燦2

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，四川 雅安 625014；2.涼山州中澤新技術(shù)開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司，四川 西昌 615000）

查爾酮合酶（chalcone synthase，Chs）與查爾酮異構(gòu)酶（chalcone isomerase，Chi）是植物類(lèi)黃酮合成代謝途徑中的兩個(gè)關(guān)鍵酶。采用同源克隆、反轉(zhuǎn) 錄聚合酶鏈?zhǔn)椒?應(yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）、融合引物嵌套PCR（fusion primer and nested integrated PCR，F(xiàn)PNI-PCR）與3’-cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)（rapid amplification of cDNA end，RACE）相結(jié)合，分別 克隆出油橄欖chs與chi基因全長(zhǎng)。序列分析表明，油橄欖chs基因全長(zhǎng)DNA（GenBank登錄號(hào)：KF935223.1）和cDNA（GenBank登錄號(hào)：KF935224.1）序列分別為2 085 bp和1 173 bp，該基因的開(kāi)放閱讀框（open read ing frame，ORF）編碼390 個(gè)氨基酸，其氨基酸序列與葡萄和番茄全長(zhǎng)Chs氨基酸序列的相似度在90%左右。生物信息學(xué)分析表明，該基因編碼的蛋白屬于Chs蛋白家族。油橄欖chi基因全長(zhǎng)DNA（GenBank登錄號(hào)：KF886190）和cDNA（GenBank登錄號(hào)：KF886191）序列分別為1 373 bp和750 bp，其ORF編碼249 個(gè)氨基酸，該氨基酸序列與已報(bào)道的其他植物Chi氨基酸序列的相似度最高在65%左右，序列中包含一段由198 個(gè)氨基酸殘基組成的具有分子內(nèi)裂解酶活性的功能域，符合 Chi蛋白家族特征。

油橄欖；查爾酮合酶；查爾酮異構(gòu)酶；基因克隆；序列分析

油橄欖（Olea europaea）屬于木犀科，木樨欖屬，常綠闊葉喬木，其果實(shí)主要用來(lái)壓榨生產(chǎn)有“液體黃金”之稱的橄欖油[1-2]。在油橄欖中除脂肪酸外關(guān)注較多的是具有抗氧化活性的物質(zhì)，其中以黃酮類(lèi)化合物最具代表性[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)，黃酮在植物遭受輻射損傷、病蟲(chóng)害與病原菌侵染等逆境脅迫過(guò)程中發(fā)揮著重要的抗逆作用，同時(shí)也與植物花朵和果實(shí)顏色的形成有著密切的關(guān)系[5-6]，此外還可以作為藥物具有抗氧化、抗癌和改善心血管系統(tǒng)等多種藥理作用[7-9]，很具開(kāi)發(fā)潛力和研究?jī)r(jià)值。

查爾酮合酶（chalcone synthase，Chs）與查爾酮異構(gòu)酶（c halcone isomerase，Chi）是植物類(lèi)黃酮合成代謝途徑中的兩個(gè)關(guān)鍵酶。1分子黃酮類(lèi)化合物共同生物合成前體的4-香豆酰CoA（4-coumaroyl CoA）與3分子的丙二酰CoA（malonyl CoA）在Chs的催化下生成黃酮類(lèi)物質(zhì)15碳骨架結(jié)構(gòu)的查爾酮，查爾酮在Chi的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)殍制に豙5，10-12]，查爾酮與柚皮素均可以作為底物進(jìn)入其他不同黃酮類(lèi)物質(zhì)的合成代謝支路[5]。目前對(duì)植物chs與chi基因的研究多集中在糧食、蔬菜和花卉等草本植物，而在木本植物中則相對(duì)較少，雖然有關(guān)于油橄欖中這兩個(gè)基因片段的報(bào)道，如國(guó)家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）中已收錄了油橄欖chs基因 571 bp的cDNA片段（GenBank登錄號(hào)：AF384049.1）與chi基因500 bp的cDNA片段（GenBank登錄號(hào)：GU646679.1），但缺乏對(duì)這兩個(gè)關(guān)鍵酶 基因完整序列以及結(jié)構(gòu)分析等方面的研究。本研究在油橄欖chs與chi基因片段的基礎(chǔ)上，采用同源克隆、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）、融合引物嵌套PCR（fusion primer and nested integrated PCR，F(xiàn)PNI-PCR）與3’-cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)（rapid amplification of cDNA end，RACE）相結(jié)合，分別克隆出油橄欖chs與chi基因的全長(zhǎng)DNA與cDNA，并分析了基因以及編碼蛋白的分子特征與功能屬性，以期為今后從分子水平揭示油橄欖黃酮的合成代謝調(diào)控機(jī)制、抗逆作用機(jī)理以及改良種質(zhì)資源等研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)材料取自西昌涼山州中澤新技術(shù)開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司北河油橄欖種植基地配多靈品種的幼嫩葉片。

植物RNA提取試劑盒 天恩澤基 因科技有限公司；通用型DNA純化回收試劑盒、質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞 天根生化科技（北京）有限公司；Premix Taq、PrimeSTAR?Max DNA Polymerase、pMDTM19-T Vector Cloning Kit、PrimeScriptTMRT Reagent Kit 日本TaKaRa公司；實(shí)驗(yàn)中所合成的引物 美國(guó)Invitrogen公司；其他 化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

A100/A200型基因擴(kuò)增儀 郎基科學(xué)儀器有限公司；DYY-6B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 北京市六一儀器廠；UV-3000型紫外分析儀 上海嘉鵬科技有限公司；HG303-4電熱恒溫培養(yǎng)箱 南京電器三廠；HYA恒溫?fù)u床 中國(guó)科學(xué)院武漢科學(xué)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 油橄欖總DNA與總RNA的提取及cDNA第一鏈的制備

采用改良的C T A B法提取油橄欖葉片中的總DNA[13]；抽提葉片總RNA后，用PrimeScriptTMRT Reagent Kit和自備引物3’CDS Primer A[14]（實(shí)驗(yàn)中所用引物見(jiàn)表1）合成油橄欖cDNA第一鏈。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物Table 1 Primers used in this study

1.3.2 基因的克隆與測(cè)序

根據(jù)同源序列比對(duì)結(jié)果與NCBI中收錄的油橄欖chs基因的cDNA片段序列分別設(shè)計(jì)擴(kuò)增油橄欖chs基因片段的上下游引物SU與SD，根據(jù)NCBI中收錄的油橄欖chi基因的cDNA片段序列設(shè)計(jì)一對(duì)上下游引物IU與ID，以總DNA為模板分別擴(kuò)增油橄欖chs與chi基因的DNA片段，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)膠回收后與T載體進(jìn)行連接，再經(jīng)轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子擴(kuò)大培養(yǎng)后提質(zhì)粒測(cè)序。

根據(jù)測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)擴(kuò)增油橄欖chs基因5’端未知序列的3 條巢式特異引物AS1、AS2、AS3。以總DNA為模板，用特異引物AS1與 另設(shè)計(jì)的融合有特異引物接頭的隨機(jī)引物FAD1、FAD2、FAD3、FAD4分別進(jìn)行第一輪PCR反應(yīng)，反應(yīng)參數(shù)：94 ℃ 1 min，98 ℃ 1 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，5 個(gè)循環(huán)；94 ℃ 30 s，25 ℃ 3 min，72 ℃ 2 min；（94 ℃ 30 s，55 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，2 個(gè)循環(huán)；94 ℃ 30 s，44 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min）15 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃結(jié)束[15]。以第一輪PCR產(chǎn)物為模板，用特異引物AS2與FSP1進(jìn)行第 二輪PCR反應(yīng)，反應(yīng)參數(shù)：94 ℃ 1 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 2 min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃結(jié)束[15]。以第二輪PCR產(chǎn)物 為模板，用特異引物AS3與FSP2進(jìn)行第三輪PCR反應(yīng)，反應(yīng)參數(shù)：94 ℃ 1 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 15 s，72 ℃ 2 min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃結(jié)束[15]。對(duì)第三輪有明顯條帶的PCR產(chǎn)物回收連接克隆后進(jìn)行測(cè)序。根據(jù)chi基因的測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)擴(kuò)增其5’端未知序列的3 條巢式特異引物AI1、AI2、AI3，而后操作程序同上，特異引物的Tm見(jiàn)表1。

根據(jù)油橄欖chs基因的cDNA片段序列設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增其3’端未知cDNA的兩條巢式特異引物ZS1與ZS2。以反轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈為模板，用特異引物ZS1與通用引物UPML和UPMS（兩者物質(zhì)的量之比為1∶5）一起進(jìn)行第一輪PCR反應(yīng)，反應(yīng)參數(shù)：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，5 個(gè)循環(huán)；94 ℃ 30 s，66 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，5 個(gè)循環(huán)；94 ℃ 30 s，61 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，20 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃結(jié)束[14]。以第一輪PCR產(chǎn)物為模板，用特異引物ZS2與通用引物NUP進(jìn)行第二輪PCR反應(yīng)，反應(yīng)參數(shù)：94 ℃ 1 min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 15 s，72 ℃ 2 min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃結(jié)束[14]。對(duì)第二輪有明顯條帶的PCR產(chǎn)物回收連接克隆后進(jìn)行測(cè)序。用巢式特異引物ZI1與ZI2擴(kuò)增油橄欖chi基因3’端未知cDNA，特異引物的Tm見(jiàn)表1，操作程序同上。

確定基因兩端的非翻譯區(qū)（untranslated regions，UTR）后，在基因兩端分別設(shè)計(jì)擴(kuò)增油橄欖chs基因全長(zhǎng)的上下游引物HSU和HSD與擴(kuò)增油橄欖chi基因全長(zhǎng)的上下游引物HIU和HID，分別以油橄欖總DNA與cDNA第一鏈為模板擴(kuò)增基因的全長(zhǎng)DNA與cDNA。

1.3.3 序列的生物信息學(xué)分析

序列比對(duì)分析確定基因的外顯子、內(nèi)含子、開(kāi)放閱讀框（open reading frame，ORF）以及所編碼的氨基酸序列，并進(jìn)行相似度分析；采用SignalP-4.1進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)；利用SOPMA與SWISS-MODEL進(jìn)行蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)分析；用SMART進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析；利用MEGA 5構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因克隆

用引物SU與SD擴(kuò)增油橄欖chs基因片段，電泳檢測(cè)到一條1 700 bp左右的條帶（圖1a），用引物IU與ID擴(kuò)增油橄欖chi基因片段，電泳檢測(cè)到一條800 bp左右的條帶（圖1b），經(jīng)序列分析確定為油橄欖chs與chi基因的DNA片段。

圖1 1 chschs（a）與achichi（b）基因片段的擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplified products of chs (a) and chi (b) gene fragments

擴(kuò)增油橄欖chs基因的5’端未知序列時(shí)，用引物FAD1～FAD4進(jìn)行的巢式PCR均擴(kuò)增出了明亮的條帶（圖2a），但FAD4的終產(chǎn)物分子質(zhì)量最大，有700 bp左右，最終選取該條帶測(cè)序。擴(kuò)增油橄欖chi基因的5’端未知序列時(shí)，只有用引物FAD3進(jìn)行的巢式PCR擴(kuò)增出一條約500 bp的明亮條帶（圖2b）。測(cè)序結(jié)果經(jīng)序列比對(duì)分析表明，均獲得了包括油橄欖chs與chi基因起始密碼子ATG在內(nèi)的5’端未知序列。擴(kuò)增油橄欖chs與chi基因的3’端未知序列，最終均獲得一條550 bp左右的明亮條帶（圖3），測(cè)序結(jié)果顯示已擴(kuò)增到以上兩個(gè)基因包括Poly A在內(nèi)的3’端cDNA序列。

圖2 擴(kuò)增chs（a）與chi（b）基因的5端未知序列Fig.2 Amplification of the 5’-unknown sequences of chs (a) and chi (b) genes

圖3 3 chschs（a）與achichi（b）基因的33’-RACE擴(kuò)增ACEFig.3 3’-RACE products of chs (a) and chi (b) genes

圖4 4 chschs（a）與achichi（b）基因全長(zhǎng)的擴(kuò)增Fig.4 Amplification of the full-length chs (a) and chi (b) genes

用引物HSU與HSD擴(kuò)增油橄欖chs基因的全長(zhǎng)DNA與cDNA，分別得到一條2 200 bp左右與一條1 300 bp左右的條帶（圖4a），測(cè)序結(jié)果為2 219 bp與1 307 bp。用引物HIU與HID擴(kuò)增油橄欖chi基因的全長(zhǎng)DNA與cDNA，分別得到一條1 400 bp左右與一條800 bp左右的條帶（圖4b），測(cè)序結(jié)果為1 397 bp與774 bp。

2.2 基因的核苷酸序列分析

克隆獲得的油橄欖chs基因全長(zhǎng)DNA（GenBank登錄號(hào)：KF935223.1）包含有3 個(gè)外顯子（65～242、884 ～1 576、1 848～2 149 bp），兩個(gè)內(nèi)含子核苷酸序列均符合典型的gt-ag剪切方式，全長(zhǎng)cDNA（GenBank登錄號(hào)：KF935224.1）包含一個(gè)1 173 bp的完整ORF，編碼一條390 個(gè)氨基酸的多肽鏈（圖5a）。序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，油橄欖與NCBI中已收錄的金魚(yú)草chs基因相似度最高，兩者完整ORF的相似度為78.35%，其次與牽牛花、葡萄和洋地黃的相似度在76%～78%之間。

所克隆的油橄欖chi基因全長(zhǎng)DNA（GenBank登錄號(hào)：KF886190）包含4 個(gè)外顯子（23～128、221～379、785～1 008、1 135～1 395 bp），3 個(gè)內(nèi)含子均符合gt-ag剪切方式，全長(zhǎng)cDNA （GenBank登錄號(hào)：KF886191）中有一個(gè)編碼249 個(gè)氨基酸多肽鏈的完整ORF（圖5b）。同源比對(duì)顯示油橄欖與薔薇科的梨和櫻桃相似度較高，完整ORF的相似度分別為68.84%與67.81%，與山茶科的茶樹(shù)、忍冬科的金銀花的相似度分別為66.8%和64.59%。

2.3 編碼的氨基酸序列分析

氨基酸序列同源比對(duì)發(fā)現(xiàn)，油橄欖Chs多肽鏈中有3 段較長(zhǎng)的保守序列（第174～198、254～273、367～386位），其完整多肽鏈序列與葡萄的相似度最高，相似度為90.26%，與番茄和馬鈴薯的相似度分別為90.00%和89.49%。經(jīng)ProtParam在線分析，油橄欖Chs多肽鏈的分子質(zhì)量為43.044 5 kD，等電點(diǎn)為6.24，含有44 個(gè)帶正電荷的氨基酸殘基，48 個(gè)帶負(fù)電荷的氨基酸殘基，分子式為C1915H3053N519O568S19，不穩(wěn)定系數(shù)為42.98，屬于不穩(wěn)定性蛋白。采用SignalP-4.1預(yù)測(cè)油橄欖Chs蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)。

油橄欖Chi與梨、櫻桃、茶樹(shù)、金銀花以及唇形科的黃芩和藿香的相似度相對(duì)較高，完整多肽鏈序列的相似度分別為63.86%、64.66%、64.54%、65.87%、65.06%、 61.78%。該蛋白的分子質(zhì)量為26.64 kD，等電點(diǎn)為6.01，含有25 個(gè)帶正電荷的氨基酸殘基，27 個(gè)帶負(fù)電荷的氨基酸殘基，分子式為C1202H1890N306O368S4，不穩(wěn)定系數(shù)為45.58，屬于不穩(wěn)定性蛋白。蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)油橄欖Chi蛋白存在于細(xì)胞質(zhì)。

2.4 油橄欖Chs與Chi蛋白的結(jié)構(gòu)分析

用S O P M A與S W I S S-M O D E L在線進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析顯示，油橄欖Chs蛋白中有44.36%的α-螺旋區(qū)、6.92%的β-轉(zhuǎn)角和33.08%的無(wú)規(guī)卷曲（圖6）。用SMART在線進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析顯示，油橄欖C h s的 N端包含一段具有酰基轉(zhuǎn)移酶活性的結(jié)構(gòu)域，C端包含一段具有氨基酰基轉(zhuǎn)移酶活性的結(jié)構(gòu)域，序列內(nèi)部包含一段3-氧酰基-[酰基載體蛋白（acyl carrier protein，ACP）]合酶Ⅲ結(jié)構(gòu)域，多肽鏈中最長(zhǎng)的氨基酸保守序列（AKDLAENNKGARVLVVCSEITAVTF）就位于該結(jié)構(gòu)域內(nèi)，屬于Chs蛋白家族中的一員。

圖5 油橄欖chschs（a）與achichi（b）基因的核苷酸序列和編碼的氨 基酸序列Fig.5 The nucleotide sequences and deduced amino acid sequences of chs (a) and chi (b) gen es from O. eu ropaea

圖6 油橄欖Chs蛋白的二級(jí)（a）和三級(jí)（b）結(jié)構(gòu)分析Fig.6 Protein structure analysis of Chs from O. europaea

蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析顯示，油橄欖Chi蛋白中有9 處α-螺旋，合計(jì)占序列全長(zhǎng)的42.57%；有10 處β-轉(zhuǎn)角，占序列全長(zhǎng)的8.03%；無(wú)規(guī)卷曲有19 處，占序列全長(zhǎng)的32.53%（圖7a）；其中6處較大的α-螺旋在同源建模生成的三維條帶圖中清晰可見(jiàn)（圖7b）。結(jié)構(gòu)域分析顯示油橄欖Chi蛋白包含一段有198 個(gè)氨基酸殘基組成的具有分子內(nèi)裂解酶活性的功能域，該功能域中有一段Bet v 1結(jié)構(gòu)域，符合Chi蛋白家族特征。帶有Bet v 1結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)廣泛存在于雙子葉植物的細(xì)胞質(zhì)中，與植物的發(fā)病機(jī)理有著密切的聯(lián)系，其大量表達(dá)與病原體感染、創(chuàng)傷或其他外界脅迫因素密切相關(guān)[16-17]，這也就從分子水平上解釋了植物在遭受逆境脅迫時(shí)其組織細(xì)胞中黃酮含量升高的原因。

圖7 油橄欖Chi蛋白的二級(jí)（a）和三級(jí)（b）結(jié)構(gòu)分析Fig.7 Protein structure analysis of Chi from O. europaea

2.5 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建

利用MEGA 5軟件通過(guò)鄰接法構(gòu)建植物Chs氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示（圖8a），在植物分類(lèi)學(xué)中同屬于菊亞綱的油橄欖、洋地黃、金魚(yú)草、藿香和紫蘇在進(jìn)化樹(shù)中同處于一個(gè)大的分支，表明它們有著共同的起源或進(jìn)化模式。基于Chi氨基酸序列構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)反映油橄欖與甘薯和花生的親緣關(guān)系要近于其他物種（圖8b），但它們?cè)谥参锓诸?lèi)學(xué)中的親緣關(guān)系相差較遠(yuǎn)，由此可見(jiàn)，依據(jù)Chi氨基酸序列構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)不能完全真實(shí)地反映不同物種間的自然演化進(jìn)程，其結(jié)果對(duì)于明確判斷植物間的親緣關(guān)系僅能提供一定的參考。

圖8 不同來(lái)源的Chs（a）與Chi（b）氨基酸序列聚類(lèi)結(jié)果Fig.8 Phylogenetic analysis of amino acid sequences of Chs (a) and Chi (b) from different plants

3 討 論

植物Chs是Ⅲ型聚酮合酶家族中的一員，分子遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，在進(jìn)化過(guò)程中該酶的功能可能有多次轉(zhuǎn)變[18]。植物chs基因?yàn)槎嗷蚣易澹诓煌M織器官中存在著不同的表達(dá)模式[19]，從而影響著植物組織中黃酮種類(lèi)與含量的分布。由于植物的花朵發(fā)揮著特殊的生理功能，一般情況下植物花朵中chs基因的表達(dá)量最高[20]。鑒于chs基因在分化方向與表達(dá)模式等方面的多樣性，因此非常適合作為研究基因表達(dá)調(diào)控與調(diào)查基因家族起源的模式系統(tǒng)。對(duì)已報(bào)道的植物chs基因分析發(fā)現(xiàn)，除了金魚(yú)草、虎杖與苔蘚外[21-22]，絕大多數(shù)植物chs基因均由2 個(gè)外顯子和1 個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成，但在本實(shí)驗(yàn)中克隆到的油橄欖chs基因和金魚(yú)草中該基因一樣有3 個(gè)外顯子和2 個(gè)內(nèi)含子，且兩者編碼序列的同源性在所有比對(duì)序列中最高，表明它們可能有著相似的演化進(jìn)程。不過(guò)經(jīng)序列分析發(fā)現(xiàn)，油橄欖chs基因的內(nèi)含子1位于第60位半胱氨酸密碼子內(nèi)部，在第一與第二個(gè)堿基之間，外顯子1編碼59 個(gè)氨基酸，其保守性低于外顯子2、3，油橄欖Chs蛋白富含可能參與同源二聚體形成的亮氨酸，活性中心由4 個(gè)高度保守的氨基酸殘基（C164、H303、N336、F215）構(gòu)成，在多肽鏈的C端有典型的Chs多基因家族特異標(biāo)簽序列WGVLFGFGPG，從這些高度一致的特征可以看出植物中chs基因的結(jié)構(gòu)趨于保守[23]，推測(cè)該基因可能有著共同的起源。

Chi是類(lèi)黃酮合成途徑中第一個(gè)被認(rèn)識(shí)的酶，在該途徑中發(fā)揮著重要的 承接作用，由Chi參與的查爾酮異構(gòu)化反應(yīng)速率是自發(fā)異構(gòu)化反應(yīng)速率的107倍，且在酶促反應(yīng)中有99.999%以上的產(chǎn)物可以直接作為下一步代謝反應(yīng)的底物[24-25]，植物chi基因表達(dá)常發(fā)生在生命活動(dòng)旺盛的部位推測(cè)與該酶高效的催化活性有關(guān)。Chi蛋白具有特殊的三維折疊結(jié)構(gòu)，因此很適合作為植物特有的基因標(biāo)記[26]。根據(jù)作用底物的不同可以把植物中的Chi分為兩類(lèi)：Ⅰ型Chi只能催化6’-羥基查爾酮轉(zhuǎn)化為5’-羥基黃烷酮；Ⅱ型Chi則可以催化6’-羥基查爾酮和6’-脫氧查爾酮分別生成相應(yīng)的5’-羥基黃烷酮和5’-脫氧黃烷酮[27]，此外在某些微生物中發(fā)現(xiàn)了與植物直系同源的Chi[28]。Ⅰ型Chi在絕大多數(shù)植物中均有存在，在豆科植物中發(fā)現(xiàn)的Chi則屬于Ⅱ型，僅在刺甘草與百脈根等豆科植物中發(fā)現(xiàn)有以上兩種類(lèi)型Chi的存在[27，29]，據(jù)此推測(cè)油橄欖chi基因編碼的蛋白屬于Ⅰ型，催化底物為6’-羥基查爾酮。蛋白功能位點(diǎn)分析表明油橄欖Chi的氨基酸序列中存在著4 個(gè)重要的催化位點(diǎn)T50、Y108、N115、S192與7 個(gè)底物結(jié)合位點(diǎn)R38、G39、L40、F49、I52、K111、V112，研究發(fā)現(xiàn)在豆科植物中Ⅱ型Chi的第192位左右的氨基酸常由T替換了S[24]，由此更進(jìn)一步確定油橄欖Chi屬于Ⅰ型。油橄欖chi基因和大多數(shù)植物chi基因一樣有典型的結(jié)構(gòu)，由4 個(gè)外顯子和3 個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成，有資料顯示大麥chi有3 個(gè)外顯子[30]，白菜的Brchi-2、甘藍(lán)的Bochi-2以及甘藍(lán)型油菜的Bnchi-2均有5 個(gè)內(nèi)含子[31]，在豆科植物光葉百脈根5號(hào)染色體上串聯(lián)的4 個(gè)chi基因中，除了Ljchi-2含有3 個(gè)外顯子外，其他均與典型結(jié)構(gòu)相符[27]，chi基因內(nèi)含子表現(xiàn)出的這種多樣性有可能會(huì)為研究該基因的演化發(fā)展提供相關(guān)的模型。

對(duì)植物球莖、花藥與花冠發(fā)育過(guò)程的研究發(fā)現(xiàn)，Chs與Chi的積累和消失受紫外光輻射誘導(dǎo)調(diào)控，并且存在協(xié)同效應(yīng)[32]。分子水平上的研究發(fā)現(xiàn)植物Chs、Chi與二氫黃酮醇-4-還原酶是以多酶復(fù)合體的形式存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)來(lái)行使催化功能的[33]，在這個(gè)多酶復(fù)合體中，chi基因的大量表達(dá)可受外界損傷、病原菌感染以及輻射等多種因素誘導(dǎo)，因此Chi是類(lèi)黃酮合成途徑中一個(gè)重要的節(jié)點(diǎn)。科研人員[34]將水母雪蓮的chi基因轉(zhuǎn)入煙草，結(jié)果提高了煙草總黃酮的含量，將外源chs基因和黃酮醇合酶基因共同轉(zhuǎn)入番茄后提高了番茄中黃酮醇的含量[35]，將二氫黃酮醇-4-還原酶基因、chs和chi基因與共同轉(zhuǎn)化至馬鈴薯后提高了花色素苷的含量[36]，最終均改善了植株的抗氧化能力，但是僅將外源chs基因?qū)?入矮牽牛與煙草則出現(xiàn)了共抑制現(xiàn)象，且在矮牽牛中還發(fā)現(xiàn)了雄性不育現(xiàn)象[37-38]。因此對(duì)基因功能的研究是一個(gè)復(fù)雜的探索過(guò)程，在利用基因工程方法對(duì)傳統(tǒng)的種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳改良時(shí)，有必要對(duì)功能基因結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系進(jìn)行深入的探索，并且要充分考慮到它們的生理效應(yīng)以及遺傳效應(yīng)。

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Cloning and Characterization of Full-Length Chalcone Synthase and Chalcone Isomerase Genes from Olea europaea

CHEN Wenshuan1， HUANG Qianming1，*， CHEN Huaping1， YANG Zeshen2， WANG Anyi2， SU Guangcan2
(1. College of Science， Sichuan Agricultural University， Ya’an 625014， China; 2. Liang Shan Zhong Ze New Technology Development Co. Ltd.， Xichang 615000， China)

Chalcone synthase (Chs) and chalcone isomerase (Chi) are two key enzymes in the biosynthesis pathway of plant flavonoids. The complete genes of chs and chi were isolated from Olea europaea by homology cloning， RT-PCR， FPNI-PCR (fusion primer and nested integrated PCR) and 3’-RACE (rapid amplification of cDNA end). Sequence analysis showed that the full-length DNA (GenBank No: KF 935223.1) and cDNA (GenBank No: KF935224.1) of chs gene from O. europaea were 2 085 bp and 1 173 bp， resp ectively， and the ORF (open reading frame) of chs gene encoded 390 amino acid residues，which showed high similarity (about 90%) with the complete amino acid sequences of Chs from Vitis vinifera an d Solanum lycopersi cum. Bioinformatics analysis showed that the protein encoded by chs gene from O. europaea belonged to the Chs protein family. The full-length DNA (GenBank No: KF886190) and cDN A (GenBank No: KF886191) of chi gene from O. europaea were 1 373 bp and 750 bp， respectively， and the ORF of chi gene encoded 249 amino acids residues. With the highest similarity (about 65%) to the comple te amino acid sequences of Chi from the other plants ， the ful l-length amino acid sequence of Chi from O. europaea had an intramolecular lyase domain with 198 amino acids， which was consistent with the characteristics of the Chi protein family.

Olea europaea; chalcone synthase (Chs); chalcone isomerase (Chi); gene cloning; sequence analysis

Q943.2

A

1002-6630（2015）09-0117-08

10.7506/spkx1002-6630-201509022

2014-06-30

四川省科技廳科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（12ZC2220）

陳文拴（1988—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)樯锘瘜W(xué)與分子生物學(xué)。E-mail：chenwenshuan@126.com

*通信作者：黃乾明（1964—），男，教授，博士，研究方向?yàn)樯锘瘜W(xué)與分子生物學(xué)。E-mail：huangqianming2014@126.com