sCTLA－4與早期梅毒血清固定的相關性

劉樹萍史同新?孫 敏徐敬星李 民姜玉暇

sCTLA－4與早期梅毒血清固定的相關性

劉樹萍1史同新1?孫 敏1徐敬星2李 民2姜玉暇2

目的: 明確血清可溶性T細胞相關抗原－4(sCTLA－4)與早期梅毒血清固定的相關性。方法: ELISA檢測60例早期梅毒血清固定患者、20例早期梅毒治療后血清學轉陰患者及20名健康志愿者血清中sCTLA－4水平；同時對血清固定患者sCTLA－4水平與RPR滴度及臨床分期進行相關分析。結果: 早期梅毒血清固定患者外周血sCTLA－4水平明顯高于血清學轉陰組及健康志愿者，差異有統計學意義(P＜0.05)。血清sCTLA－4水平與血清RPR固定滴度及臨床分期無相關性(P＞0.05)。結論: 血清sCTLA－4表達水平增高可能與早期梅毒血清固定相關。

梅毒； 血清固定； 可溶性細胞毒T細胞相關抗原－4

梅毒是一種性傳播疾病，多數患者經正規驅梅治療后非梅毒螺旋體抗原血清學試驗在一定時間內轉陰，但仍有15.00%～34.02%1的梅毒患者治療后該類試驗維持在某一水平不變而形成血清固定(sero－resistance)。2，3發生血清固定的具體機制目前尚不明確。免疫學研究表明，血清固定患者存在免疫失衡和細胞免疫抑制。4細胞毒T細胞相關抗原－4(cytotoxic T－lymphocyte associated antigen 4，CTLA－4)具有抗炎和免疫抑制作用，5sCTLA－4是其可溶性形式，它同樣是CTLA－4基因轉錄的產物，其生物學活性同CTLA－4，6尚未見其在梅毒血清固定中作用的研究。因此，本實驗通過對梅毒血清固定患者的血清sCTLA－4水平的檢測，初步了解其在梅毒血清固定形成中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床資料 收集2013年5月至2014年6月于本院、青島市皮膚病防治院及青島市市立醫院就診的梅毒血清固定患者60例。其中男33例，女27例；年齡20～54歲，平均34.22±8.88歲；一期梅毒19例，二期梅毒41例。陰轉組為經正規驅梅治療后血清學轉陰患者共20例，男12例，女8例。平均年齡36.45 ±8.25歲。其中，一期梅毒9例，二期梅毒11例。對照組為本院及青島市市立醫院查體中心20名健康志愿者。所有觀察對象均排除HIV感染。3組觀察對象在年齡及性別上均無統計學差異。入選標準:7，8早期梅毒患者；治療后6個月以上RPR及TRUST試驗檢測均陽性；RPR滴度1∶1～1∶8。血清固定后經過2～4個規范療程的復治。所有研究對象均無神經系統的臨床癥狀及體征，且腦脊液生化及常規正常，腦脊

液RPR及TRUST檢測均為陰性，排除神經梅毒。排除標準:9－12惡性腫瘤患者，SLE、Graves病等自身免疫性疾病患者，合并其他感染性疾病及性傳播疾病患者，近期有不潔性行為者。

1.1.2 標本 抽取患者及健康對照者空腹血3 mL置于不含熱源和內毒素的試管中，操作過程中避免任何細胞刺激，3000 r/min離心10 min，將血清小心分離后保存于－20℃冰箱內待測。

1.1.3 試劑 人共刺激分子CTLA－4(CD152)ELISA檢測試劑盒(北京諾亞杰公司提供，為進口分裝產品)；RPR及TRUST檢測試劑盒(上海榮盛生物藥業有限公司)。

1.2 方法 sCTLA－4的檢測采用雙抗體一步夾心法酶聯免疫吸附試驗(ELISA法)進行檢測。檢測范圍3.12 ng/mL～100 ng/mL。實驗操作嚴格按說明書進行。操作結束后15 min內于450 nm波長測吸光度(OD值)，并根據線形曲線方程計算sCTLA－4濃度，用酶標儀(Rayto RT－6000，深圳雷社生命科學股份有限公司)直接打印結果。RPR檢測由青島大學醫學院附屬醫院檢驗科按照說明書完成。

1.3 統計學方法 用SPSS 17.0對數據進行分析。不同組別間sCTLA－4水平比較以 ˉx±s表示，采用單因素ANOVA檢驗，若差異具有顯著性則進一步行LSD檢驗作組間兩兩比較；對血清固定患者按其臨床相關因素分類的sCTLA－4水平比較以中位數及四分位數間距表示，采用秩和檢驗(Kruskal－Wallis檢驗或Mann－Whitney U檢驗)。P＜0.05為有統計學意義。

2 結果

2.1 不同組別外周血sCTLA－4水平比較 3組外周血sCTLA－4水平之間的差異有統計學意義(P＜0.01)。進一步行LSD檢驗兩兩比較，梅毒血清固定組與梅毒血清學試驗陰轉組及健康對照組外周血sCTLA－4水平有明顯統計學差異(P＜0.01)。而梅毒治療后血清學陰轉組和健康對照組之間外周血sCTLA－4水平無顯著性差異(P＞0.05)。見表1。

表1 3組觀察對象血清sCTLA－4測定結果

2.2 血清固定組外周血sCTLA－4水平與臨床相關性的比較 將梅毒血清固定組外周血sCTLA－4水平與患者性別因素、血清固定滴度以及臨床分期進行相關性分析，結果均無統計學意義(P＞0.05)，見表2。

表2 血清固定患者血sCTLA－4水平與臨床參數比較

3 討論

目前國內外對于梅毒出現血清固定的具體時間尚無統一判定標準。為符合梅毒治療的早期足量規范的原則，而定義在早期梅毒6個月、晚期梅毒12個月較為合理。13臨床上血清固定發生率較高，患者容易出現情緒障礙，嚴重影響其生活質量。14因此探討梅毒血清固定形成的原因有重要的臨床意義，它將有助于臨床醫生更好的掌握梅毒的治療，減少梅毒血清固定的產生。

目前，對于梅毒血清固定形成機制的研究眾多，其中的免疫學因素15－17是目前研究的熱點，尤其是T細胞免疫在梅毒血清固定中的作用研究。國內外數個基于不同研究對象的細胞免疫學研究表明，梅毒血清固定患者有嚴重的Th1/Th2免疫失衡和細胞免疫抑制。有研究發現梅毒血清固定患者較健康人和驅梅治療后血清學轉陰者調節性T細胞比例升高，IL－6、IFN－γ水平降低，而IL－10水平升高。18與健康人相比，血清固定患者外周血淋巴細胞中Treg細胞比例及其轉錄因子Foxp3的表達升高，而Th17細胞比例及其轉錄因子ROR－γt的表達降低，19進一步證實了血清固定患者存在細胞免疫抑制。

CTLA－4屬于免疫球蛋白超家族，它通過下調T細胞的功能而達到抑制免疫的作用。其具體作用機制有如下研究和假說20－23:(1)可介導不依賴Fas途徑的T細胞凋亡。(2)促進TGF－β產生，抑制IL－2的分泌及細胞由G0/G1期向S期的轉化從而抑制T細胞的功能。(3)與CD28競爭性結合B7而阻斷共刺激信號的傳遞，從而抑制T細胞的功能及活化。(4)促進酪氨酸SHP－2與TCR/CD3ζ結合，使 TCRP/ CD3ζ復合物脫磷酸，從而使TCR不能傳遞T細胞活化信號，抑制T細胞的活化。綜上可見CTLA－4在細胞免疫中的重要地位。

本研究結果發現，梅毒血清固定患者血清中sCTLA－4的水平明顯高于血清學轉陰組及健康人群，同

時血清學陰轉組水平與健康人群無明顯差異性，說明CTLA－4的免疫抑制作用可能在梅毒血清固定的形成中起到某些影響。同時還發現血清中sCTLA－4的水平與患者的性別、血清固定的滴度、臨床分期無明顯相關。

總之，sCTLA－4可能參與了梅毒血清固定的形成，但是本研究樣本量較少，對結果的分析可能產生誤差，有待進一步的臨床研究證實。

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(收稿:2014－11－13 修回:2014－12－12)

Correlation between the level of sCTLA－4 and seroresistance in the patientswith early syphilis

LIU Shu－ping，SHITong－xin，SUNMin，etal.The Affiliated Hospital ofMedical College Qingdao University，Qingdao，266003

Objective:To determine the correlation between soluble cytotoxic T lymphocyte associated antigen－4(sCTLA－4)and seroresistance in the patientswith early syphilis.M ethods:The serum level of sCTLA－4 wasmeasured by ELISA in 60 seroresistance syphilis patients，20 syphilis patientswhose antibodies in the sera were negativity after treatment and 20 healthy controls.The correlation between the level of sCTLA－4 and the RPR titers and the stage of syphilis were analyzed among the non－seroresistance patients after treatment.Results:The level of sCTLA－4 in seroresistance group was significantly higher than that in other two groups(P＜0.05).Therewas no correlation between the level of sCTLA－4 and the RPR titers and the stage of syphilis(P＞0.05).Conclusion:The sCTLA－4may relate to the developmentofseroresistance in the patients with early syphilis.

syphilis；seroresistance；sCTLA－4

山東省自然科學基金資助項目(編號:ZR2010HM113)

1青島大學醫學院附屬醫院，山東青島，266003 2青島大學醫學院附屬青島市市立醫院皮膚科，山東青島，266001?通信作者