四種醫院制劑微生物限度檢查法驗證試驗

楊靜　李曉翠　徐軼飛

[摘要] 目的 建立四種醫院制劑的微生物限度檢查方法。 方法 按照《中國藥典》2010年版一部附錄微生物限度檢查法進行試驗，對四種醫院制劑進行了微生物限度檢查方法的驗證。 結果 通過試驗建立了四種醫院制劑的微生物限度檢查方法。 結論 復方大承氣口服液、防風解毒口服液可采用常規法，呋柳擦劑、復方土荊皮酊可采用薄膜過濾法檢查微生物限度。

[關鍵詞] 醫院制劑；抑菌作用；微生物限度檢查；方法驗證

[中圖分類號] R95 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2015）19-51-03

[Abstract] Objective To establish microbial limit test of 4 hospital preparations. Methods 4 hospital preparations was received microbial limit test according to microbial limit test in appendix I of 2010 edition of Chinese Pharmacopoeia. Results Microbial limit test of 4 hospital preparations was established by experiment. Conclusion Compound Dachengqi Oral and Detoxification Oral can adopt routine methods to test microbial limit.Fu Liu liniment and Compound tincture pseudolaric can adopt membrane filtration method to test microbial limit.

[Key words] Hospital preparations；Bacteriostasis；Microbial limit test；Verification test

四種醫院制劑均為含多種成分的復方制劑，處方組成比較復雜，其中呋柳擦劑與復方土荊皮酊處方中均含有水楊酸、苯甲酸成分，具有抗表皮真菌、止癢作用，用于手癬、腳癬、體癬等各種皮膚癬癥。由處方和功效可知，這兩種制劑具有一定的抑菌作用，含抑菌成分的醫院制劑的微生物限度檢查，必須先消除供試液的抑菌活性，然后再根據中國藥典規定的方法進行檢查[1-3]。復方大承氣口服液是由大黃、芒硝、赤芍、桃仁、萊菔子、厚樸絲等藥材組成，具有化瘀行氣、通里攻下的作用，用于治療各型腸梗阻。防風解毒口服液主要由白芷、防風、荊芥、紫蘇葉、桂枝、桔梗等藥材經加工而成，具有發散風寒、辛溫解表的作用。醫院制劑沒有規定具體的微生物限度檢查方法，根據國家藥典委員會的要求，按照《中國藥典》2010年版一部附錄微生物限度檢查法，分別對四種醫院制劑進行了方法的驗證，為規范醫院制劑的微生物限度檢查方法，提供了科學的依據。通過驗證，復方大承氣口服液、防風解毒口服液可用常規法進行微生物限度檢查。呋柳擦劑與復方土荊皮酊細菌計數采用薄膜過濾法檢查，霉菌和酵母菌計數采用常規法檢查。

1 資料與方法

1.1 儀器

HTY-2000 集菌儀（杭州泰林醫療器械廠）；GH-6000隔水式培養箱（天津泰斯特儀器有限公司）；LRH-250-MS霉菌培養箱（韶關泰宏醫療器械有限公司）；DF3-3紅外線高溫干燥箱（北京興爭儀器設備廠）；LDZX立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫療器械廠）。

1.2 菌種

大腸埃希菌（Escherichia coli）[CMCC（B）44102]、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[CMCC（B）63501]、金黃色葡萄球菌（Staphy lococcus aureus）[CMCC（B）26003]、白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC（F）98001]、黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC（F）98003]均購于中國藥品生物制品檢定所。

1.3 培養基及試藥

營養瓊脂、玫瑰紅鈉瓊脂、營養肉湯、改良馬丁、改良馬丁瓊脂、膽鹽乳糖、pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液（批號分別為131218、1312192、131016、1309122、120113、140110、140124）均購自中國藥品生物制品檢定所。

1.4 樣品

呋柳擦劑（北京軍區北戴河療養院，批號：20120917）、復方大承氣口服液（解放軍第261醫院，批號：121022）、復方土荊皮酊（解放軍白求恩國際和平醫院，批號：20120524）、防風解毒口服液（解放軍第261醫院，批號：121105）。

2 方法

按照《中國藥典》2010 年版一部[4]附錄XⅢ C 微生物限度檢查法進行驗證試驗。

2.1 菌液的制備

（1）取經37℃培養18～24h的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的營養肉湯培養物1mL， 用0.9%無菌氯化鈉溶液10倍稀釋制成每1mL含菌數為50～100cfu的菌懸液，備用。

（2）取經25～28℃培養18～24h的白色念珠菌的改良馬丁液體培養物1mL，用0.9%無菌氯化鈉溶液10倍稀釋制成每1mL含菌數為50～100cfu的菌懸液，備用。

（3）取經25～28℃培養5～7d的黑曲霉改良馬丁瓊脂斜面培養物，加入3～5mL 0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫，吸出孢子懸液，用0.9%無菌氯化鈉溶液10倍稀釋制成每1ml含菌數為50～100cfu的菌懸液，備用。endprint

2.2 供試液的制備

分別取供試品lOmL，加入pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100mL，搖勻，制成1∶10的供試液。

2.3 細菌、霉菌及酵母茵計數方法的驗證

試驗組（1）常規法：取1∶10的供試液1mL和50～100cfu試驗菌，注入平皿中，每皿加15～20mL營養瓊脂培養基，搖勻、培養、觀察結果。各試驗菌株的回收率結果，見表l。（2）培養基稀釋法：分別取1∶10的供試液0.5、0.2mL和50～100cfu試驗菌，注入平皿中，每皿加15～20mL營養瓊脂培養基，搖勻、培養、觀察結果。（3）薄膜過濾法：取1∶10的供試液10mL加入薄膜過濾器中，全量通過薄膜后，再用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗濾膜，沖洗量為100 mL/膜，在沖洗液中加入50～100cfu試驗菌，濾干，將濾膜貼至營養瓊脂培養基平板上，培養觀察結果。

菌液組：除不加供試液外，其余操作同試驗組。

供試品對照組：除不加試驗菌外，其余操作同試驗組。

稀釋劑對照組：用稀釋液代替供試液，其余操作同試驗組。

3 結果

3.1 常規法

從表1的回收率試驗結果可以看出：采用常規法，復方大承氣口服液和防風解毒口服液對5種試驗菌株的回收率均>70%，無明顯抗菌活性，細菌、霉菌及酵母菌計數均可用常規法檢查；復方土荊皮酊對金黃色葡萄球菌、枯草芽胞桿菌和白色念珠菌的回收率均<70%，有明顯的抑菌作用；呋柳擦劑對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的回收率均<70%，對枯草芽胞桿菌的回收率為0，說明有顯著的抑菌作用。結果見表1。

3.2 培養基稀釋法

從表2的回收率試驗結果可以看出：采用培養基稀釋法后，復方土荊皮酊對對枯草芽胞桿菌的回收率<70%；呋柳擦劑對金黃色葡萄球菌和枯草芽胞桿菌的回收率均<70%，因此，采用培養基稀釋法，復方土荊皮酊和呋柳擦劑仍有較強的抑菌活性。見表2。

3.3 薄膜過濾法

從表3的回收率試驗結果可以看出：采用薄膜過濾法后，復方土荊皮酊和呋柳擦劑對金黃色葡萄球菌和枯草芽胞桿菌的回收率均>70%，消除了抑菌活性，細菌計數均可用薄膜過濾法，霉菌和酵母菌計數采用常規法檢查。見表3。

4 討論

醫院制劑療效確切，價格低廉，深受群眾歡迎，因此，質量控制尤其是微生物限度檢查顯得尤為重要[5-8]，只有建立科學的檢查方法，完善、提高醫院制劑的質量標準評價體系，才能有效提高醫院制劑的監管水平。

呋柳擦劑和復方土荊皮酊的處方中均含有水楊酸和苯甲酸，這兩種成分對微生物的生長有一定的抑制性，藥品中污染的微生物在這些成分的影響下有可能檢不出，但是當抑菌成分消除后或濃度降低時，這些微生物便可復蘇并繁殖，如果按照常規法進行檢查，可能會造成檢驗結果的漏檢或者誤判[9-16]。因此分別采用培養基稀釋法、常規法和薄膜過濾法逐一進行了驗證，來降低或消除抑菌成分對試驗的干擾，以證明所采用的方法適合于該藥物微生物限度檢查。試驗中發現，在制備呋柳擦劑和復方土荊皮酊的供試液時，由于處方中均含有水楊酸和苯甲酸，加入稀釋液后易產生絮狀沉淀，因此應充分搖勻保證試驗的平行性和有效性。在稀釋菌液時采用了旋渦混懸器進行混勻，這種方法本研究在以往的文獻中尚未查到，是在反復的試驗、思考中摸索而來，此法耗時短，方法簡單，不需用吸管反復吹打，降低了勞動強度，提高了工作效率。

[參考文獻]

[1] 任敬超.含抑菌成分中成藥固體制劑微生物限度檢查驗證方法的建立[J].黑龍江科技信息，2007，11（12）：209.

[2] 柳冬梅，殷生楠.10種醫院制劑微生物限度檢查法驗證[J].醫學理論與實踐，2010，23（1）：1-3.

[3] 王知堅，邵惠琴，杜蕓，等. 藥品微生物限度檢查法有效性驗證實驗研究[J].中國現代應用藥學，2004，21（3）：211-213.

[4] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（二部）[S].北京：中國醫藥科技出版社，2010：附錄79.

[5] 周定.兩種醫院制劑微生物限度檢查法的建立[J].中國社區醫師（醫學專業），2011，12（3）：162-163.

[6] 莫小林，伍小燕，韋振源，等.10種中藥制劑微生物限度檢查方法學的驗證[J].中國實驗方劑學雜志，2012，19（13）：56-59.

[7] 杜平華，朱世真，趙魯青.藥品微生物限度檢查預實驗及方法驗證的探討[J].中國藥品標準，2003，4（3）：52-53.

[8] 蘇德模，馬緒榮.中國藥品生物制品檢定所 微生物分類學 藥品微生物學檢驗技術[M].北京：華齡出版社，2007：209-217.

[9] 許威，吳虹.清熱解毒類中成藥微生物限度檢查方法驗證[J].安徽醫藥，2012，16（5）：605-607.

[10] 陳菡.10%硫軟膏微生物限度檢查的方法驗證[J].安徽醫藥，2015，19（4）：632-635.

[11] 容凱文，王秉鈞，林曉凱.熱毒清顆粒及通淋排石顆粒微生物限度檢查法的建立[J].臨床醫藥實踐，2010，37（8）：405-407.

[12] 潘雯，關倩明，林玲.7種具有抑菌成分中成藥的微生物限度檢查方法驗證[J].廣東藥學院學報，2012，28（6）：623-627.

[13] 楊育林，吉瑩潔.五種醫院制劑微生物限度檢查方法驗證[J].亞太傳統醫藥，2014，10（23）：24-25.

[14] 馬越，特玉香，杜平華，等.16種中成藥微生物限度檢查法方法驗證[J].中國藥品標準，2005，6（6）：12-15.

[15] 陳媛，吳楣，藍紅梅，等.3種醫院軟膏劑微生物限度檢查方法學研究[J].中國醫藥科學，2014，4（12）：105-107.

[16] 丘展鋒，黃國玉.硝酸咪康唑乳膏微生物限度檢查驗證[J].中國現代藥物應用，2010，4（16）：153-154.

（收稿日期：2015-06-26）endprint