川翠3號黃瓜S S R指紋圖譜的構建及種子純度鑒定

楊宏 ，劉小俊 ，梁根云 ，李躍建

（1.四川省農業科學院園藝研究所/蔬菜種質與品種創新四川省重點實驗室，成都，610066；2.農業部西南地區園藝作物生物學與種質創制重點實驗室）

種子純度鑒定是保證種子質量的關鍵環節。傳統的種子形態學鑒定、幼苗鑒定法不適用于黃瓜種子純度鑒定。田間小區種植鑒定法，周期長、費用高，無法滿足種子貿易中快速鑒定的要求，且受環境影響大，結果不夠準確。DNA電泳鑒定技術為種子的純度鑒定提供了一種更為快速、高效的方法，可以彌補其他純度鑒定技術中的許多缺陷，具有以下優點：在植物任何組織的任何發育時期均可用于分析；多態性位點分布廣，遺傳穩定；不受任何環境因素的影響。

SSR引物共顯性的特點在雜交種純度鑒定具有獨特優勢，已在水稻[1～4]、玉米[5]、棉花[6，7]、油菜[8，9]、茄子[10]、大白菜[11]、花椰菜[12]、黃瓜[13]等多種作物上應用。SSR的位點特異性和日益豐富的標記群體使SSR成為基因精細定位及作圖的有力工具。目前黃瓜已開發的SSR標記已有2 000多對[14～16]，位點多，分布均勻，檢測區域覆蓋黃瓜7條染色體。利用SSR分子標記，黃瓜葉片苦味、矮化、果實網紋等重要基因都能夠被定位，為克隆奠定了基礎[16～18]。同時，SSR分子標記也是黃瓜種質資源多樣性分析的重要方法之一[19，20]。總之，SSR標記具有共顯性、位點特異性、位點豐富、穩定、易操作等特點，因此成為構建分子指紋圖譜的重要標記。

隨著品種保護的需求增加，加之親本退化等問題嚴重，需要建立信息更豐富的骨干材料分子指紋圖譜。川翠3號是高產優質華北型黃瓜新品種，對黃瓜霜霉病、白粉病等主要病害有較強抗性，具有較大的推廣應用前景。本文利用SSR分子標記技術，構建了川翠3號及其親本的DNA指紋圖譜，以期為該品種的權益保護、真偽鑒別、雜種純度鑒定和親本提純等提供理論依據和技術指導。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

黃瓜品種川翠3號單株100株及其親本各20株，由四川省農業科學院園藝研究所黃瓜課題組提供。供試材料于2013年7月中旬播種，7月23日定植于四川省農科院園藝所黃瓜課題組雙流基地，露地常規栽培管理。小區種植F1植株350株，田間種植按隨機區組設計，3次重復。隨機選取100株掛牌標記編號，用于SSR分析和田間性狀調查。

表1 特異多態性SSR引物及其序列

表2 川翠3號及親本的SSR指紋圖譜

1.2 試驗方法

①基因組DNA的提取 父本、母本各20株，幼嫩葉片等量混合后用CTAB法小量提取DNA。100株F1植株分單株取幼嫩葉片，分別提取DNA，且DNA試管標記號與植株田間掛牌號一致。在1%瓊脂糖凝膠上檢測DNA質量，并稀釋到適當濃度，-20℃保存備用。

②PCR擴增和電泳檢測 164對全基因組覆蓋的SSR引物來自Ren等[14]、Miao等[15]公開發表信息，由上海生工生化公司合成。SSR反應體系，總共 25 μL，包括：20 ng 模板 DNA，前后引物各1.0 μmol/L，10×PCR Buffer 2.5 μL，1.0 U Taq 酶 ，0.2 mmol/L dNTPs。SSR擴增體系為：94℃預變性5 min；94℃變性 30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，30次循環；最后72℃延伸10 min。采用8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠，180 V電泳2.5 h后檢測PCR擴增產物，獲得親本和雜交種的擴增條帶，銀染顯色后記錄結果。SSR標記的數據記錄根據電泳結果采用0、1系統描述條帶的相對位置，條帶清晰的記為1，缺失的則記為0，依據分子量從小到大的順序讀帶，不具多態性的條帶不予統計。

③田間純度鑒定 9月中旬對100株標記單株進行田間純度鑒定。田間純度鑒定方法為主要差異表型性狀比對，調查性狀有：株型、株高、葉形、節間長度、瓜形、瓜色、果實表面蠟粉、瓜把、瓜長等。

2 結果與分析

2.1 雜交種共顯性標記的篩選

用164對SSR引物對親本DNA進行擴增，每對引物擴增的位點為1～2個，片段大小介于100～500 bp。擴增后電泳檢測顯示12對引物親本間有多態性，多態性比例為7.31%。其中4對引物（ssr17922、ssr07220、ssr18718、ssr02385） 在 F1中呈共顯性（表1），條帶清晰，親本特征片段分子量差異大于10 bp，分別位于1號、3號和6號染色體。這4對SSR引物擴增出的條帶可以明確區分雜交種F1和親本（圖1）。這4對引物組成了川翠3號及其親本的DNA指紋圖譜（表2）。

2.2 雜交種SSR純度鑒定

利用 ssr17922、ssr07220、ssr18718、ssr02385 4 對引物對100株F1進行鑒定。結果顯示，這4對引物在99株單株中均擴增出含雙親條帶的雜合帶型，1株為母本基因型（圖2、3）。因此，分子標記鑒定結果表明，該100株單株中有真雜種99株，純度為99.0%，1株假雜種為母本。

圖1 共顯性引物 ssr17922（A）、ssr07220（B）、ssr18718（C）、ssr02385（D）對雜交種黃瓜川翠3號及其親本擴增產物電泳

2.3 雜交種田間鑒定

盛果期對100株標記單株進行田間鑒定，其中99株表現一致，所有農藝性狀均符合川翠3號黃瓜植物學性狀描述，顯示為真雜種，1株雜株的植物學性狀與母本一致。因此，田間鑒定結果表明，該100株單株的純度為99.0%，1株假雜種為母本混雜。

圖2 引物ssr17922對雜交種黃瓜川翠3號及其親本擴增產物電泳

圖3 引物ssr07220對雜交種黃瓜川翠3號及其親本擴增產物電泳

3 討論與結論

本試驗結果表明，田間鑒定與分子標記鑒定結果均顯示該100株雜種群體的純度為99.0%，且假雜種田間編號與分子標記純度鑒定的編號一致。因此，分子標記純度鑒定方法準確、有效，可代替田間純度鑒定。

研究發現的4對引物ssr17922、ssr07220、ssr18718、ssr02385在川翠3號黃瓜及其親本中呈共顯性，條帶清晰、穩定、易識別，這些特殊SSR條帶構成了該品種及其親本的指紋圖譜。使用ssr17922、ssr07220、ssr18718、ssr02385 中的任何一組引物都能準確迅速地鑒定川翠3號及其親本，4組引物可以鑒別川翠3號和其他品種。川翠3號指紋圖譜的構建不僅能為該品種真偽鑒別和材料提純提供技術支持，為黃瓜新品種的審定和保護提供重要依據，并在新品種的DUS測試和品種資源遺傳多樣性的評價等方面具有重要的應用價值。此外，該指紋圖譜還能為川翠3號相關表型性狀基因的定位分析提供信息，縮小引物篩選范圍，同時為同類型華北型黃瓜純度鑒定提供可供選擇的標記。

使用分子標記開展純度鑒定迅速、準確，可節省大量人力和時間。雜交種純度低不僅損害經營企業的聲譽和利益，縮短品種的推廣年限，還會導致產量下降，影響農民收益。目前，種子公司經常采用的鑒定方法是將當年生產的雜交種抽樣到海南南繁基地進行田間純度檢測，形態性狀易受氣候條件和栽培措施等方面的影響，準確性較差，而且成本高、時間長。本試驗中，田間純度鑒定從播種到盛果期進行植物學性狀調查，耗時2個月，且催芽、育苗、整地、定植、田間管理、植物學性狀調查等需要大量人工，而應用分子標記進行純度鑒定需要催芽、提取DNA、PCR和凝膠電泳，選取1對引物進行分析鑒定，整個周期約1周，且鑒定結果準確，不受環境影響。

本研究中，親本間多態性引物僅占164對引物的7.31%，表明川翠3號黃瓜親本間遺傳背景較窄。性狀調查表明，該品種親本間差異僅能通過瓜色、瓜形的差異來判斷，容易誤判并且在無瓜情況下很難判斷品種真實性。使用SSR分子標記能大大提高純度鑒定的準確性，是窄遺傳背景雜交種子純度鑒定的有效方法。

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