SPE-GC-GC-TOFMS檢測油脂中游離甾醇及精 煉廢棄油脂的判別

徐寶成，張良曉，王 華*，楊青青，羅登林，李培武,6,7,8,*

（1.西北農林科技大學食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100；2.中國農業科學院油料作物研究所，湖北 武漢 430062；3.河南科技大學食品與生物工程學院，河南 洛陽 471003；4.農業部油料及制品質量監督檢驗測試中心，湖北 武漢 430062；5.西北農林科技大學葡萄酒學院，陜西葡萄與葡萄酒工程技術中心，陜西 楊凌 712100；6.農業部油料產品質量安全風險評估實驗室，湖北 武漢 430062；7.農業部油料作物生物學重點實驗室，湖北 武漢 430062；8.農業部生物毒素檢測重點實驗室，湖北 武漢 430062）

SPE-GC-GC-TOFMS檢測油脂中游離甾醇及精 煉廢棄油脂的判別

徐寶成1,2,3，張良曉2,4，王 華5,*，楊青青2,6，羅登林3，李培武2,4,6,7,8,*

（1.西北農林科技大學食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100；2.中國農業科學院油料作物研究所，湖北 武漢 430062；3.河南科技大學食品與生物工程學院，河南 洛陽 471003；4.農業部油料及制品質量監督檢驗測試中心，湖北 武漢 430062；5.西北農林科技大學葡萄酒學院，陜西葡萄與葡萄酒工程技術中心，陜西 楊凌 712100；6.農業部油料產品質量安全風險評估實驗室，湖北 武漢 430062；7.農業部油料作物生物學重點實驗室，湖北 武漢 430062；8.農業部生物毒素檢測重點實驗室，湖北 武漢 430062）

研究開發一種基于固相萃取的植物油中游離甾醇的快速分離及多維氣相色譜串聯飛行時間質譜檢測方法。與普通一維氣相色譜相比，14 種游離甾醇及β-香樹脂醇的三甲基硅烷化衍生物在多維氣相色譜上得到了更好地分離，并且檢測靈敏度更高。方 法學驗證結果表明：膽固醇、菜籽甾醇、蕓薹甾醇和β-谷甾醇的檢出限分別為0.03、0.04、0.04 mg/100 g油和0.05 mg/100 g油，定量限分別為0.06、0.08、0.08 mg/100g油和0.08 mg/100g油，在不同添加水平條件下的加標回收率皆高于93%，相對標準偏差在1.4%～10.0%之間。同時，利用本方法對6 種商品植物油及25 份精煉廢棄油脂中的游離甾醇進行檢測，并分析其在植物油和廢棄油脂中的分布模式，提出了以判別指數對廢棄油脂進行鑒別的方法，結果顯示25 份精煉廢棄油脂被完全正確識別。

多維氣相色譜-飛行時間質譜；固相萃取；游離甾醇；精煉廢棄油脂；判別

甾醇屬于三萜烯類化合物，是油料作物的一組特異性次生代謝物，它們在植物油中的含量和組成能夠反映食用油的種類[1-2]。植物甾醇在油脂中以游離態和結合態2 種形式存在，其中結合態又可以分為甾醇脂肪酸酯、甾醇酚酸酯、甾基糖苷以及酰化甾基糖苷4 類[3-4]。目前，植物油中甾醇的測定一般先將油脂進行皂化，然后再進行分離檢測，這種方法測得游離態和甾醇酯類的含量之和[5-11]；另一種方法則是先 將油脂進行酸、堿水解，再進行甾醇的分離檢測，可測得4 類甾醇總含量[12]。然而關于油脂中14 種游離甾醇的分離及檢測方法則未見報道。

每種植物油都具有特征性的甾醇組成，其組成模式是鑒定食用油真偽的重要依據。Gázquez-Evangelista等[13]利用離線預處理高效液相色譜結合氣相色譜-火焰離子檢測器（high performance liquid chromatographygas chromatography-flame ionization detector，HPLC-GCFID）檢測不同植物油中甾醇的含量并建立了其指紋圖譜，成功地對特級初榨橄欖油、橄欖果渣油、葵花籽油和大豆油進行區分和鑒別。然而，上述方法需要復雜的樣品前處理包括皂化、不皂化物的萃取等步驟，過程費時費力且消耗大量的有機溶劑。為了使甾醇信息更好地應用于食用植物油的保真與摻偽鑒別，本研究基于固相萃取（solid phase extraction，SPE）及多維氣相色譜串聯飛行時間質譜（multidimensional gas chromatography coupled to time-of-flight mass spectrometry，GC-GCTOFMS），開發了一種新的植物油游離甾醇的快速分離及檢測方法，并對常見6 種植物油及25 份精煉廢棄油脂（refined waste oil，RWO）進行了檢測；同時通過對6 種常見植物油及精煉廢棄油脂樣品中14 種游離甾醇及β-香樹脂醇的分布模式及含量的分析，提出用判別指數（discriminated index，DI）鑒別精煉廢棄油脂，為精煉油脂的鑒別提供一種參考方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

商品大豆油（12 種）、花生油（18 種）、菜籽油（7 種）、葵花籽油（10 種）、玉米胚芽油（7 種）中國檢驗檢疫科學研究院；商品大豆油（11 種）、菜籽油（15 種）、葵花籽油（5 種）、玉米胚芽油（5 種）、棉籽油（10 種） 市購；精煉廢棄油脂25 份 國家食品安全與風險評估中心。以上油脂樣品避光、貯藏在4 ℃的環境中，以供分析。

膽固醇（3β-cholest-5-en-3-ol，純度99%）、膽甾烷醇（5α-cholestan-3β-ol，分析純）、菜油甾醇（[24S]-24-methyl cholesta-5,22-dien-3β-ol，分析純）、蕓薹甾醇（[24R]-24-methyl chole st-5-en-3β-ol，純度98%）、豆甾醇（[24S]-24-ethyl cholesta-5,22-dien-3β-ol，純度95%）、β-谷甾醇（[24R]-24-ethyl cholest-5-en-3β-ol，純度≥97%）和N-甲基-N-三甲基硅烷七氟丁酰胺（N-trimethylsilyl-N-methylheptafluorobutyramide，MSHFBA） 美國Sigma-Aldrich公司；1-甲基咪唑（純度99.0%） 國藥集團化學試劑有限公司；正己烷（色譜純）、乙醚（分析純） 天津天力化學試劑有限公司；無水硫酸鈉（分析純） 天津市東麗區天大化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

多維氣相色譜-飛行時間質譜（配有Pegasus 4D GC×GC-TOFMS軟件，版本為4.43.3.0） 美國Leco公司；一維毛細管色譜柱：HP-5MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm）、二維毛細管色譜柱：DB-17ht（1.5 m× 0.10 mm，0.15 μm） 美國安捷倫公司；ASPEC XL型-固相萃取儀 美國Gilson公司；旋轉蒸發儀 德國Heidolph公司；固相萃取柱（二氧化硅，0.5 g/6 mL）北京迪馬科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 游離甾醇的分離

上樣液的制備：準確稱取0.05g（精確到小數點后4 位）油樣，并加入20 μg膽甾烷醇內標，然后用5 mL正己烷溶液溶解，渦旋振蕩均勻，備用。

SPE柱的活化：稱取1.0 g無水硫酸鈉加到SPE柱的上方，然后用10 mL正己烷溶液活化，流速1.5 mL/min，棄去流出液；上樣：將5 mL樣品液注入到SPE柱中，控制流速1.2 mL/min，棄去流出液；淋洗：用10 mL體積分數5%乙醚-正己烷溶液進行淋洗，除去甘油三酯和甾醇酯類化合物，流速控制在1.2 mL/min，棄去流出液；洗脫：用10 mL體積分數為20%乙醚-正己烷溶液洗脫游離甾醇并收集于潔凈干燥的試管中，流速控制在1.5 mL/min。

1.3.2 甾醇的甲基硅烷化衍生

根據ISO 12228∶1999 Animal and vegetable fats and oils-determination of individual and total sterols contents-gas chromatographic method[14]的方法，對1.3.1節中得到的甾醇類化合物進行硅烷化衍生。將1.3.1節中得到的10 mL洗脫液在40 ℃真空旋轉蒸發至大約1 mL，然后轉移到反應瓶中，用氮氣緩緩吹干溶劑，再加入100 μL硅烷化試劑（MSHFBA∶1-甲基咪唑=95∶5，V/V），旋緊反應瓶蓋，放于105 ℃恒溫箱中反應15 min，然后冷卻至室溫供分析。

1.3.3 色譜條件

多維GC分析中包含2 根毛細管色譜柱，其中一維柱為HP-5MS，二維柱為DB-17ht。進樣口溫度320 ℃；載氣為氦氣；流速0.8 mL/min；進樣量1 μL；分流比20∶1。一維爐溫箱的升溫程序：初始溫度190 ℃，保持1 min，然后以5 ℃/min升到305 ℃，并保持25 min；二維爐溫箱的溫度比一維爐溫箱高10 ℃，升溫程序保持一致。調制器溫度補償25 ℃。

1.3.4 質譜條件

電子電離源；電子能量70 eV；傳輸線溫度300 ℃；檢測器電壓1 750 V；離子源溫度250 ℃。質譜數據采集頻率10 次/s；掃描質量數m/z 50～600；溶劑延遲600 s。實驗數據的處理使用LECO公司Pegasus 4D GC×GCTOFMS軟件，版本為4.43.3.0。

1.3.5 定性和定量分析

定性分析：根據各甾醇的相對保留時間（relative retention times，RRTs，以膽固醇為基準，其中膽固醇的RRT為1.000），并將其質譜圖與NIST譜庫的標準質譜圖進行比對，對油脂樣品中的甾醇進行定性。各甾醇三甲基硅醚的相對保留時間和重要定性離子如表1所示。

定量分析：對于不飽和的甾醇采用內標法進行定量，標準曲線的每個質量濃度點各加20 μg內標，其中膽固醇、菜油甾醇、蕓薹甾醇以及β-谷甾醇內標曲線的質量濃度梯度分別為：0.1、0.2、0.4、0.8、1.5、3.0 μg/100 μL；0.1、1、5、10、20、30 μg/100 μL；1、5、10、20、30、40 μg/100μL；10、20、40、80、120、140 μg/100μL；豆甾醇的質量濃度梯度與蕓薹甾醇相同。對于油樣中的β-香樹脂醇和其他不飽和甾醇（24-亞甲基膽固醇、Δ7-蕓薹甾烯醇、Δ5,23-豆甾二烯醇、Δ5-燕麥甾烯醇、Δ5,24-豆甾二烯醇、Δ7-豆甾烯醇和Δ7-燕麥甾烯醇），其含量的估算統一使用豆甾醇內標曲線，曲線中豆甾醇的質量濃度梯度為0.1、0.5、1、2、4、8、16 μg/100μL。油脂樣品中飽和甾醇（蕓薹甾烷醇、谷甾烷醇）在結構上和內標相似度最高，因此通過和樣品中內標直接相比后便可計算其含量，響應因子為1.0。各甾醇三甲基硅醚的定量離子組合如表1所示。油脂樣品中游離甾醇含量以mg/100 g表示，每個樣品獨立平行測定3 次，以其平均值做進一步的數據分析。

表 1 甾醇三甲基硅烷化衍生物的GC-GC-TOFMS分析結果Table 1 GC-GC-TOFMS results of trimethylsilyl sterol ethers

1.3.6 方法驗證

空白油樣的獲得：根據1.3節中樣品前處理的方法，將500 mg花生油溶解于5 mL正己烷中，然后進行上樣和淋洗，并將5 mL上樣流出液和10 mL淋洗流出液收集于潔凈干燥的試管中，然后將其濃縮至5 mL，作為第2次處理的上樣液。以同樣的步驟進行第2、第3次和第4次處理，并將第4次的上樣流出液和淋洗流出液（共計15 mL）收集于潔凈干燥的試管中，再用氮氣緩緩將溶劑吹干，得到空白的花生油樣。該空白油樣經檢測未發現游離甾醇，然后將其轉移到棕色玻璃瓶中，密封后避光貯藏在—28 ℃的冰箱中，備用。

方法的檢出限（limit of detection，LOD）、定量限（limit of quantifi cation，LOQ）、線性范圍、重復性和回收率實驗根據分析方法驗證標準進行[15]。

2 結果與分析

2.1 GC-GC-TOFMS分析

油脂樣品中的游離甾醇經過SPE分離和硅烷化衍生后用GC-GC-TOFMS進行分析，結果表明：14 種游離甾醇和β-香樹脂醇的硅烷化衍生物在HP-5MS串聯DB-17ht的二維GC上可以得到很好地分離，如圖1所示。和Toledano等[16]報道的30 m單柱（0.25 mm×0.25 μm，質量分數5%苯基聚甲基硅酮毛細管柱）相比，各甾醇三甲基硅醚在GC-GC上得到了更好地分離；另外，24-亞甲基膽固醇、蕓薹甾醇和蕓薹甾烷醇在GC-GC上的分離效果也比50 m SE-54單柱（0.25 mm×0.10 μm）的分離效果要好[14]。根據各甾醇三甲基硅醚的RRTs和MS數據，可以對油脂樣品中的游離甾醇逐一確定，結果如表1所示。不同于其他文獻[17-22]報道，本研究可以同時分離和檢測植物油中14 種游離甾醇（表1）和一種甾醇類似物（β-香樹脂醇），并通過分析它們在不同油脂中的含量及分布模式，尋找精煉廢棄油脂和正常食用植物油的差別。

圖 1 大豆油（17號樣品）中游離甾醇SPE萃取物經過硅烷化衍生后的多維氣相色譜-飛行時間質譜色譜圖Fig.1 GC-GC-TOFMS chromatogram of silylated fre e sterols extracted from soybean oil (sample 17) by SPE

2.2 方法驗證

根據方法學驗證標準[15]，按照質量濃度從高到低的原則依次向空白花生油樣中添加代表性甾醇進行方法的LOD和LOQ實驗，結果見表2。由于各游離甾醇在不同種類油脂樣品中的含量有較大的差異，因此各標準曲線建立時應根據其在樣品中的實際含量范圍選擇合適的質量濃度梯度（如本研究1.4節定量分析所述），數據經回歸擬合后得到各游離甾醇的計算公式，其相關系數（R2）都不小于0.997 3，表明在整個定量質量濃度范圍內GCGC-TOFMS的響應都具有較好的線性關系。為了驗證整個方法的準確度和重復性，將膽固醇、菜籽甾醇、蕓薹甾醇以及β-谷甾醇在3 個不同質量濃度水平（低、中、高）分別添加到空白花生油中，然后經過SPE分離和硅烷化衍生后進行GC-GC-TOFMS分析，并計算各甾醇在不同添加水平條件下的回收率和精密度（重復性），結果如表2所示。從表2可以看出，各甾醇在不同添加水平條件下平均回收率都不小于93%，并且其精密度符合方法學驗證標準的要求[15]，低質量濃度添加時甾醇實測值的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）最大為10.0%，高質量濃度添加時其RSD最小為1.4%，這也表明本方法具有良好的準確度和重復性。

表 2 方法學驗證結果Table 2 Validation of the established method

2.3 常見植物油和精煉廢棄油脂樣品分析

表 3 典型大豆油中游離甾醇的分布模式及含量Table 3 The distribution mode of free phytosterols and their contents in typical soybean oil

為確保在日常檢測中方法的穩定性，在每天進行正式樣品檢測前需先進行質控（quality control，QC）樣品的測定，每次獨立平行測定3 次，考察回收率和精密度。QC樣品是在空白花生油中分別添加一定量的菜籽甾醇（35 mg/100 g）、蕓薹甾醇（35 mg/100 g）、豆甾 醇（35 mg/100g）和谷甾醇（140 mg/100g）而制得。結果表明，在整個樣品檢測期間，QC樣品中各甾醇的平均回收率不小于97%，各甾醇實測值的RSD小于3%（n=3），表明方法的穩定性較好。在本研究的實驗條件下對所有油脂樣品進行了分析，其中典型大豆油游離甾醇分布模式及含量如表3所示。從表3可以看出，大豆油中主要的游離甾醇是β-谷甾醇、豆甾醇和蕓薹甾醇，另外還含有一定量的Δ5-燕麥甾烯醇、β-香樹脂醇、Δ7-豆甾烯醇和谷甾烷醇，而其他甾醇的含量則較低，這和Lechner等[23]的報道是一致的。

為能夠正確區分和識別精煉廢棄油脂，本研究對6 種商品植物油及25 份精煉廢棄油脂中14 種游離甾醇及β-香樹脂醇的分布模式及含量進行了分析，找到3 種關鍵性游離甾醇，分別是膽固醇、Δ5-燕麥甾烯醇和Δ5,24-豆甾二烯醇。同時，提出DI，即：正常食用油（或精煉廢棄油脂）中的Δ5-燕麥甾烯醇和Δ5,24-豆甾二烯醇二者含量之和與其膽固醇含量的比值。通常來講，因反復加熱和過度精煉以及引入動物油脂成分的緣故，精煉廢棄油脂中Δ5-燕麥甾烯醇和Δ5,24-豆甾二烯醇的含量通常會降低而膽固醇含量則會升高，因此DI更能突出廢棄油脂和正常食用油之間的差別。本研究中6 類常見植物油及25 份精煉廢棄油脂樣品的關鍵游離甾醇含量及DI值如表4所示。

表 4 6 類常見植物油及精煉廢棄油脂（RWOs）樣品的關鍵游離甾醇含量及DI值Table 4 The contents of key free phytosterols and DI values of six common vegetable oils and the refifi ned waste oils (RWOs)

從表4可以看出，在6 種植物油中膽固醇含量最高的是棉籽油，平均為1.25 mg/100g，而葵花籽油中膽固醇的含量最低，平均為0.26 mg/100g。若以膽固醇含量作為精煉廢棄油脂的判別指標并考慮到誤判風險，可以將判定閾值設為2.0 mg/100g。從表4可知，在25 份精煉廢棄油脂中共有15 份樣品的膽固醇含量大于2.0 mg/100g，其中含量最高的是RWO21，膽固醇為146.80 mg/100g。但是由于精煉廢棄油脂來源廣泛、成分復雜，一些煎炸老油膽固醇含量低于判定閾值[24-25]，此時利用膽固醇作為判定指標漏檢率較高。而本研究提出的DI值可以大大降低假陽性和假陰性。各種植物油中葵花籽油的DI值最大，平均為64.55；而大豆油、菜籽油和棉籽油的DI值比較接近，分別為9.37、10.31和9.25。從理論上來講，以上6 種植物油之間任意進行調配，其DI值都應該不小于棉籽油的DI值，因此本研究將精煉廢棄油脂的判定DI值設為6，對于DI小于6的樣品可以判為精煉廢棄油脂，對于DI在6～9之間的樣品則需要進一步分析其完整游離甾醇信息，或者結合其他方法進行判定。25 份精煉廢棄油脂的DI值都小于6，其中最小值為0，最大值為5.49，和正常植物油相比具有顯著性差異。對RWO15（DI=5.49）的游離甾醇進行進一步分析可以發現：該樣本具有較高的豆甾醇（27.54 mg/100 g）和相對較高的谷甾烷醇（1.03 mg/100 g），可以判定該樣本應該是大豆源的精煉廢棄油脂。本研究結果顯示，DI值在精煉廢棄油脂判定中具有較廣泛的適應性和較高的正確率。

3 結 論

本研究開發了1 種植物油中游離甾醇的SPE-GC-GCTOFMS檢測方法，與普通一維GC比，游離甾醇及β-香樹脂醇的三甲基硅烷化衍生物在多維GC上得到了更好地分離。同時，加標回收實驗和精密度實驗表明：該方法準確度高、重復性好，符合方法學驗證標準的要求。最后，利用本方法對6 種商品植物油及25 份精煉廢棄油脂中游離甾醇進行了檢測，并分析其在植物油和廢棄油脂中的分布模式及含量，提出了基于DI的廢棄油脂鑒別方法，結果顯示25份精煉廢棄油脂被完全正確識別，可以作為精煉廢棄油脂鑒別的一種參考方法。

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A Method for Determination of Free Phytosterols Derived from Vegetable Oils by SPE-GC-GC-TOFMS and Its Application for Discrimination of Refi ned Waste Oils

XU Baocheng1,2,3, ZHANG Liangxiao2,4, WANG Hua5,*, YANG Qingqing2,6, LUO Denglin3, LI Peiwu2,4,6,7,8,*
(1. College of Food Science and Engineering, Northwest A&F University, Yangling 712100, China; 2. Oil Crops Research Institute of the Chinese Academy of Agricultural Sciences, Wuhan 430062, China; 3. College of Food and Bioengineering, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471003, China; 4. Quality Inspection and Test Center for Oilseeds Products, Ministry of Agriculture, Wuhan 430062, China; 5. Shanxi Engineering Research Center for Viti-Viniculture, College of Enology, Northwest A&F University, Yangling 712100, China; 6. Laboratory of Risk Assessment for Oilseeds Products, Ministry of Agriculture, Wuhan 430062, China; 7. Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Oil Crops, Minstry of Agriculture, Wuhan 430062, China; 8. Key Laboratory of Detection for Mycotoxins, Ministry of Agriculture, Wuhan 430062, China)

In this study, a multidimensional gas chromatography coupled to time-of-flight mass spectrometry (GCGC-TOFMS) method was established to determine free sterols in edible oils extracted by rapid solid-phase extraction. Compared with conventional one-dimensional gas chromatography, a better separation and a higher detection sensitivity for trimethylsilyl derivatives of free sterols and β-amyrin were obtained by GC-GC. Meanwhile, the validation results of the established method indicated that the limits of detection for cholesterol, brassicasterol, campesterol and β-sitosterol were 0.03, 0.04, 0.04 and 0.05 mg/100 g of oil, respectively; and the limits of quantification for the four sterols were 0.06, 0.08, 0.08 and 0.08 mg/100 g of oil, respectively. In addition, the recovery rates of the selected four sterols spiked at three different levels were higher than 93% with a relative standard deviation ranging from 1.4% to 10.0%. Based on theestablished method, six types of edible oils and 25 refi ned waste oils were analyzed by GC-GC-TOFMS, and the distribution mode of free sterols in normal vegetable oils and waste oils were also analyzed. Moreover, a method based on discrimination index (DI) was proposed to identify refined waste oils, and the results indicated that the refined waste oils could be discriminated from the normal six edible oils completely.

multidimensional gas chromatography-time-of-flight-mass spectrometry (GC-GC-TOFMS); solid phase extraction (SPE); free phytosterols; refi ned wasted oils; discrimination

TS207.3

A

1002-6630（2015）02-0188-06

10.7506/spkx1002-6630-201502036

2014-07-12

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAK08B03）；“雙打”相關產品檢驗鑒定方法研究專項（2012104010-4）；

國家自然科學基金青年科學基金項目（21205118）

徐寶成（1976—），男，講師，博士研究生，研究方向為農產品質量標準與檢測技術。E-mail：xbc76@163.com

*通信作者：王華（1959—），女，教授，博士，研究方向為食品安全與質量控制。E-mail：wanghua@nwsuaf.edu.cn

李培武（1961—），男，研究員，博士，研究方向為農產品質量標準與檢測技術。E-mail：peiwuli@oilcrops.cn