2 種紅蕓豆蛋白的提取及組分分析

陳曉萌，王常青*，訾 艷，李小凡，郝志萍，陳 彤

（山西大學生命科學學院，山西 太原 030006）

2 種紅蕓豆蛋白的提取及組分分析

陳曉萌，王常青*，訾 艷，李小凡，郝志萍，陳 彤

（山西大學生命科學學院，山西 太原 030006）

分析比較了英國大紅蕓豆和山西小紅蕓豆主要營養成分和可溶性蛋白含量。并對2 種紅蕓豆清蛋白提取工藝及功能性質、亞基組成進行了研究。結果表明：大小紅蕓豆主要營養成分具有顯著性差異，可溶性蛋白含量均為清蛋白含量最高，分別為74.08%和66.50%；球蛋白含量分別為10.08%和13.05%；谷蛋白含量分別為7.23%和7.24%；醇溶蛋白含量分別為6.79%和6.12%。2 種紅蕓豆提取優化結果表明：料液比對大紅蕓豆清蛋白提取率具有極顯著影響（P＜0.01），對小紅蕓豆清蛋白提取率具有顯著影響（P＜0.05）；提取溫度、提取時間只對大紅蕓豆清蛋白的提取率有顯著影響（P＜0.05）。溶解性分析表明：2 種紅蕓豆的等電點均為pH 4.7。電泳分析表明，英國大紅蕓豆和山西小紅蕓豆清蛋白組成在19.0～44.0 kD范圍有3個條帶分布基本一致，分別為19、23、43 kD左右，在44.0～97.4 kD的分布不同。

英國大紅蕓豆；山西小紅蕓豆；營養成分；蛋白提取；功能性質；電泳

紅蕓豆（Phaseolus vulgaris Linn. sp.）學名紅菜豆，為蝶形花亞科（Faboideae）菜豆屬（Phaseolus L.）植物，根據籽粒大小不同可分為大紅蕓豆和小紅蕓豆2種[1]。本實驗中的小紅蕓豆原產于山西，百粒質量37～38 g，每百克籽粒數為260～300。大紅蕓豆原產美洲，1986年由山西省糧油食品進出口公司從英國引進，百粒質量49～50g，百克籽粒數為200～201。山西為全國紅蕓豆出口基地，全省紅蕓豆種植面積約為23萬畝，每年的出口量為3萬 t，占全國蕓豆出口量的50%以上。目前國內已有不少白蕓豆蛋白組成及營養成分的研究，但是有關紅蕓豆蛋白組成及營養成分的研究報道卻很少。有研究表明，紅蕓豆蛋白含量為24%左右[2]，不但含有豐富的B、C族維生素，鈣、鐵含量分別是雞肉的4 倍和7 倍[3]，而且也是鎂、鉀、鈉的良好來源[4]。由于英國大紅蕓豆的畝產量高、經濟效益好，所以，近年來，在紅蕓豆主產地的山西，當地的小紅蕓豆的種植面積逐漸減少；當地對小紅蕓豆和英國大紅蕓豆之間是否存在營養和品質上的較大差異持不同意見。本實驗通過研究對比大、小2種紅蕓豆主要營養成分含量及可溶性蛋白（清蛋白、谷蛋白、球蛋白和醇溶蛋白）含量對2 種紅蕓豆營養和品質做出評價。并通過研究清蛋白的提取優化、功能性質，及用電泳技術比較2種紅蕓豆清蛋白亞基的組成，旨在為大小紅蕓豆的深加工產品的開發提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山西小紅蕓豆和英國大紅蕓豆均購自山西天鎮縣創凱谷物貿易有限公司，樣品經篩選去雜、烘干、粉碎過篩后備用。

蛋白質電泳Marker 上海升正科技有限公司；氫氧化鈉、鹽酸等試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

DRZ-4型馬弗爐 天津市中環設備廠；數顯恒溫水浴提取器 國華電器有限公司；MODEL818型精密pH計 杭州奧立龍儀器有限公司；MR23冷凍離心機美國熱電公司；旋轉蒸發儀 上海申生科技有限公司；UV-2600型紫外-可見分光光度計 尤尼科（上海）儀器有限公司；DYCZ-23A型電泳儀 北京市六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 2 種紅蕓豆中主要營養成分的測定

蛋白質測定采用GB/T 5009.5—2010《食品中蛋白質的測定》；淀粉測定采用GB/T 5009.9—2008《食品中淀粉的測定》；水分測定采用GB/T 5009.3—2010《食品中水分的測定》；灰分測定采用GB/T 5009.4—2010《食品中灰分的測定》；脂肪測定采用GB/T 5009.6—2003《食品中脂肪的測定》。

1.3.2 2 種紅蕓豆清蛋白質提取的單因素試驗[5]

準確稱取紅蕓豆粉5.0 g，以蒸餾水為提取溶劑，分別以提取時間（1、2、3、4、5 h）、料液比（1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 （g/mL））、提取溫度（30、40、50、60、70、80 ℃）作為考察對象進行單因素試驗。

1.3.3 2 種紅蕓豆清蛋白質提取的正交試驗

為了進一步驗證大小紅蕓豆清蛋白的最佳提取條件，在單因素試驗的基礎上，對提取時間、料液比和提取溫度采用L9（33）進行正交試驗，通過SPSS軟件進行方差分析。

1.3.4 2 種紅蕓豆4 種蛋白的提取工藝流程

根據Osborne的蛋白溶解性分類方法[6]。取大小紅蕓豆各100 g，在以上正交試驗最佳條件下提取紅蕓豆清蛋白后，按以下工藝提取得清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白，測定蛋白含量。工藝流程見圖1。

圖 1 蕓豆蛋白分級提取工藝流程圖Fig.1 Flow diagram for fractional extraction of kidney bean proteins

1.3.5 2 種紅蕓豆清蛋白等電點的測定[7]

準確稱取紅蕓豆粉5.0 g，加10 倍的蒸餾水為提取溶劑，分別用0.1 mol/L鹽酸和氫氧化鈉溶液調節調pH值至3.5、3.8、4.1、4.4、4.7、5.0，室溫條件下2 000r/min攪拌1h，3 000 r/min離心20 min后，福林-酚法測定上清液中蛋白質含量，以牛血清蛋白質為標準。重復測定3 次，上清液中蛋白含量最低點對應的pH值即為該蛋白質的等電點。

1.3.6 2 種紅蕓豆清蛋白起泡性和起泡穩定性[8]

起泡性：取一定量的清蛋白溶液，分別在pH 3、5、7、9，5 000 r/min條件下室溫均質2 min，測定攪拌停止30 s時的體積（V30s），每個樣品重復測定3次，用體積的增加量與原來體積（V原）的百分比值表示為起泡能力。

起泡穩定性：靜置30、60min后的泡沫體積（V）與攪拌停止30s時體積（V30s）的百分比值表示泡沫穩定性。

1.3.7 2 種紅蕓豆清蛋白乳化性及乳化穩定性[9]

乳化性：取一定量150 mL的清蛋白溶液，加入色拉油30 mL，分別在pH 3、5、7、9，5 000 r/min條件下室溫均質2 min。取樣，用pH 7.0、質量分數0.1%十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）按1∶100稀釋，放置1 min后，500 nm處測定吸光度，SDS溶液作空白。重復測定3次。以1 min時的吸光度（A1）乘以稀釋倍數表示乳化性。

乳化穩定性：取樣，用pH 7.0、質量分數0.1% SDS稀釋100倍，放置10 min后，500 nm處測定吸光度，SDS溶液作空白。重復測定3次。以10 min時的吸光度（A10）乘以稀釋倍數表示乳化穩定性。

1.3.8 2 種紅蕓豆清蛋白的電泳分析

蕓豆蛋白組分的分子質量測定采用聚丙烯酰氨凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）法[10]，濃縮膠5%，分離膠12%。蛋白樣品（1～2 mg/mL）溶于0.025 mol/L pH 8.3 Tris-Gly緩沖液中，每孔加10 μL樣品進行電泳，電泳恒壓120 V進行，濃縮膠10 mA，分離膠20 mA。利用一元線性回歸分析方法，將蛋白質標準品的相對遷移率對分子質量的對數作圖得標準曲線，再根據該標準曲線的回歸方程計算清蛋白亞基的分子質量。

2 結果與分析

2.1 大小紅蕓豆的部分營養成分

大小紅蕓豆2 種原料的主要營養成分含量及對比見表1（結果均為干基含量）。大小紅蕓豆的營養組分比例基本相似，均以淀粉為主，含量占到45%以上，符合豆類物質營養成分的基本規律。其次為蛋白質，含量為22%～24.6%，與Wani等[11]報道相近，但大紅蕓豆的蛋白質、脂肪、礦物質、淀粉含量分別是小紅蕓豆的1.01、1.11、1.10、1.03 倍，且通過方差分析證明大小紅蕓豆營養組分之間具有極顯著的差異（P＜0.01）。其余未測定物質主要為粗纖維[12]。

表 1 大小紅蕓豆營養組成成分分析表Table 1 Nutritional composition of different red kidney beans

2.2 清蛋白單因素提取試驗結果

2.2.1 浸提時間對2 種紅蕓豆清蛋白提取的影響

圖 2 浸提時間對大小紅蕓豆清蛋白提取率影響對比圖Fig.2 Effect of extraction time on the extraction rate of albumin from red kidney beans

由圖2可知，大小紅蕓豆清蛋白在一定時間內均隨著時間的延長，提取率提高，這是因為蛋白質在一定時間內，隨著時間的延長，浸提入提取液的蛋白質也會隨之增加，但浸提時間過長，會發生蛋白質部分分解和變性，所以提取率先升后降[13]。大紅蕓豆在4 h左右時提取率達到最大，隨后急劇下降；小紅蕓豆則在3h左右時提取率達到最大。

圖 3 料液比對大小紅蕓豆清蛋白提取率影響對比圖Fig.3 Effect of solid-to-liquid ratio on the extraction rate of albumin from red kidney beans

2.2.2 料液比對2 種紅蕓豆清蛋白提取的影響由圖3可知，隨著提取溶液使用量的增大，清蛋白的提取率增大，當料液比達到1∶30時，蛋白質提取率達到最大值。但過高的提取溶液使用量會增大蛋白濃縮的負荷，即增大提取成本。所以在其他因素不變的條件下，提取溶液使用量不宜太高。

2.2.3 提取溫度對2 種紅蕓豆清蛋白提取的影響

圖 4 浸提溫度對大小紅蕓豆清蛋白提取率影響對比圖Fig.4 Effect of extraction temperature on the extraction rate of albumin from red kidney beans

隨著提取溫度的升高，蛋白質的提取率迅速增大，見圖4。大小紅蕓豆提取溫度分別在40 ℃和60 ℃時，蛋白質提取率達到最大，溫度繼續升高，蛋白質的溶解指數降低，且過高的溫度不僅使蛋白質變性，而且已有研究表明，高溫會影響蛋白品質、口感等，所以提取不宜采用過高的溫度。

2.3 清蛋白提取率正交試驗結果與分析

在單因素試驗的基礎上，采用L9（33）正交試驗進一步考察了不同因素對提取率的影響。

2.3.1 小紅蕓豆清蛋白正交試驗結果

由表2可以看出，影響小紅蕓豆清蛋白的提取率大小順序為C＞A＞B，即料液比＞提取溫度＞提取時間，最優組合為A3B2C3，即料液比1∶30、提取溫度65 ℃、提取時間3h。在此條件下小紅蕓豆清蛋白的提取率為57.65%。結合方差分析可知，料液比對小紅蕓豆清蛋白提取率的影響極顯著（P＜0.01），其余兩因素對小紅蕓豆清蛋白提取率的影響不顯著。

表 2 小紅蕓豆清蛋白提取正交試驗設計結果與方差分析Table 2 Results and analysis of variance of orthogonal array design for albumin extraction from Shanxi red kidney beans

2.3.2 大紅蕓豆清蛋白正交試驗結果

表 3 大紅蕓豆清蛋白提取正交試驗結果及方差分析Table 3 Results and analysis of variance of orthogonal array design for albumin extraction from British red kidney beans

如表3所示，大紅蕓豆清蛋白提取的最優工藝參數為A2B1C3，即提取溫度45℃、提取時間3h、料液比1∶30。在此條件下大紅蕓豆清蛋白的提取率為66.81%。極差分析可知，影響大紅蕓豆清蛋白質提取效果的各因素順序為：C（料液比）＞B（提取時間）＞A（提取溫度）。方差分析表明，料液比對蛋白質的提取效果極顯著（P＜0.01），提取時間和提取溫度有著顯著影響（P＜0.05），與極差分析結果一致。

2.4 2 種紅蕓豆蛋白組成分析結果

根據組成紅蕓豆中各種蛋白的溶解性，在正交試驗提取清蛋白的基礎上，分別用NaCl溶液、乙醇溶液、和pH 10的蒸餾水提取，得到了球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白。結果如表4所示，大小紅蕓豆中清蛋白含量最高，遠高于其他蛋白組分，分別為74.08%和66.50%，其次是球蛋白，但大紅蕓豆的球蛋白則比小紅蕓豆少2.97%，谷蛋白和醇溶蛋白含量接近均在7.0%左右。方差分析表明，2種紅蕓豆可溶性蛋白中，清蛋白、球蛋白、醇溶性蛋白含量之間都有極顯著的差異（P＜0.01），谷蛋白含量不具有顯著性差異。

表 4 大小紅蕓豆4 種可溶性蛋白組成差異及顯著性分析表Table 4 Difference and signififi cance analysis of four soluble proteins in red kidney beans

2.5 2 種紅蕓豆清蛋白等電點的測定結果

圖 5 大小紅蕓豆清蛋白等電點對比圖Fig.5 Isoelectric points of albumin from different red kidney beans

蛋白質的溶解性是功能性質中最重要的一個性質，它會極大地影響其他功能性質，同時又受pH值的影響。大小紅蕓豆清蛋白溶解性隨pH值變化曲線如圖5所示。小紅蕓豆清蛋白在pH 3.5～5.0時，溶解度均低于大紅蕓豆清蛋白，再次表明小紅蕓豆清蛋白含量低于大紅蕓豆清蛋白含量。隨著pH值的增加，溶解度先降低后上升。在pH 4.7時，蛋白溶解度呈現最低值。這與周大寨等[14]報道的蕓豆蛋白等電點為pH 4.7研究結果一致。一般而言，蛋白質的溶解度在其等電點附近是最低的，越遠離等電點，溶解性越好。原因是在等電點時，電荷斥力消失，從而導致蛋白分子表面電荷為零[15]。

2.6 2 種紅蕓豆清蛋白的功能性實驗

2.6.1 起泡性和起泡穩定性

蛋白含有疏水基團和親水基團，因而具有表面活性，能降低水的表面張力，在劇烈攪拌時可形成泡沫[16]。從圖6可以看出，清蛋白在中性pH值時的起泡性較低，酸性或堿性環境中均增強，似于溶解度曲線，等電點附近起泡活性差，偏離等電點起泡活性增強。這是因為蛋白質在它的表面性質起作用之前必須先溶解和移動到表面，因此蛋白質的起泡活性和溶解度之間通常呈正相關[17]。

圖 6 大小紅蕓豆清蛋白起泡性及起泡穩定性對比圖Fig.6 Foaming capacity and forming stability of albumin from different red kidney beans

2.6.2 乳化性和乳化穩定性

相同條件下不同pH值蛋白的乳化活性和乳化穩定性結果見圖7。當蛋白質pH值達9時，乳化性和乳化穩定性增加趨勢最大；同時在實驗pH值范圍內，乳化能力及其穩定性均隨蛋白pH值的增大先減小后增大，這是因為蛋白質在界面上的吸附特點為分級吸附，隨著蛋白質濃度的增加，單分子吸附層變為多分子吸附層，繼而形成排列更加緊密的有一定強度的界面膜，使得乳化能力和乳化穩定性增加[18-19]。從圖7可以看出，清蛋白在中性pH值時的乳化活性較低，酸性或堿性環境中均增強。其他幾種蛋白質的乳化曲線類似于溶解度曲線，等電點附近乳化活性差，偏離等電點乳化活性增強。許多食物蛋白的乳化活性均有類似的變化規律。這是因為蛋白質在它的表面性質起作用之前必須先溶解和移動到表面，不溶性的蛋白對乳化作用的貢獻很小，因此蛋白質的乳化性質和溶解度之間通常呈正相關[13]。此外，pH值的改變還直接影響到蛋白質分子的柔性及親水-親油性的平衡，這些因素都與蛋白質的乳化能力息息相關[20]。

圖 7 大小紅蕓豆乳化性及乳化穩定性對比圖Fig.7 Emulsifying capacity and emulsion stability of albumin from different red kidney beans

2.7 2 種紅蕓豆清蛋白亞基的電泳分析結果

圖 8 大小紅蕓豆蛋白SDS-PAGE電泳圖譜Fig.8 SDS-PAGE profi le of the proteins from different red kidney beans

由圖8可知，大小紅蕓豆清蛋白的分子質量分布均在97.4 kD以下，其中3 個條帶分布基本一致，分別為19、23、43 kD左右。大紅蕓豆清蛋白組分從小到大分別對應為19.78、22.24、23.61、35.97、43.56、47.35 kD左右，小紅蕓豆清蛋白組分從小到大分別為19.18、23.62、34.57、43.87、79.99 kD。由此可見，在25.0～34.0、44.0～66.2 kD分子質量之間大紅蕓豆比小紅蕓豆清蛋白分別多出一個條帶，但在66.2～97.4 kD之間，大紅蕓豆則沒有條帶，說明大、小紅蕓豆清蛋白的組成差異較大。

3 結 論

大小紅蕓豆的營養組分比例相似，但大紅蕓豆的蛋白質、脂肪、礦物質、淀粉含量高于小紅蕓豆，且具有極顯著的差異。清蛋白提取實驗表明，小紅蕓豆清蛋白的最佳提取條件為65 ℃、提取3 h、料液比1∶30（g/mL），此時清蛋白的提取率為57.65%；大紅蕓豆清蛋白的最佳提取條件為45 ℃、提取3 h、料液比1∶30（g/mL），此時清蛋白的提取率為66.81%。在2種紅蕓豆中，清蛋白含量最高，其次是球蛋白。但大紅蕓豆的清蛋白含量比小紅蕓豆高7.58%，而球蛋白則比小紅蕓豆少2.97%，且出谷蛋白外都具有極顯著的差異。大小紅蕓豆清蛋白均在pH 4.7時溶解度最低，因此等點電均為pH 4.7。大、小紅蕓豆清蛋白中，有19.78、23.61、43.56 kD 3 個蛋白亞基相同，大紅蕓豆清蛋白比小紅蕓豆多22.24、35.97、47.35 kD的3 個亞基；小紅蕓豆清蛋白有1 個79 kD的亞基是大紅蕓豆沒有的。

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Extraction and Analysis of Proteins from Red Kidney Beans from Different Growing Regions

CHEN Xiaomeng, WANG Changqing*, ZI Yan, LI Xiaofan, HAO Zhiping, CHEN Tong
(College of Life Science, Shanxi University, Taiyuan 030006, China)

In this experiment, the major nutrients and soluble protein contents in red kidney beans from the United Kingdom and Shanxi province, China were analyzed. The extraction, functional properties and subunit composition of albumin in red kidney beans from the two geographic origins were studied. The results showed that the major nutritional composition of British red kidney beans was signifi cantly different from that of those from Shanxi, and albumin was the most abundant soluble protein in both samples, accounting for 74.08% and 66.50% of the total amount of soluble proteins, respectively, which also contained 10.08% and 13.05% globulin, 7.23% and 7.24% gluten, and 6.79% and 6.12% prolamin, respectively. Material-to-liquid ratio had an extremely signifi cant impact (P ＜ 0.01) on the extraction rate of albumin from British red kidney beans and a signifi cant impact (P ＜ 0.05) on the extraction rate of albumin from Shanxi red kidney beans. Extraction temperature and time were also signifi cant factors for the extraction of albumin from British rather than Shanxi red kidney beans (P ＜ 0.05). Protein Isoelectric point for both samples was pH 4.7. Electrophoresis analysis showed that the distribution of albumin in these two samples was substantially the same in the range of 19.0–44.0 kD, although differences in the range of 44.0–97.4 kD were observed.

British red kidney bean; Shanxi small red kidney bean; nutrients; protein extraction; functional properties; electrophoresis

TS201.1

A

1002-6630（2015）02-0149-06

10.7506/spkx1002-6630-201502029

2014-06-28

陳曉萌（1989—），女，碩士研究生，研究方向為食品生物技術與功能食品開發。E-mail：richuriluo.ok@163.com

*通信作者：王常青（1956—），男，教授，學士，研究方向為食品生物技術與功能食品開發。E-mail：wcq@sxu.edu.cn