HPLC-Q-TOF-MS-MS測定桑椹中多酚類物質

李辰辰，陸小騰駕，童華榮*

（西南大學食品科學學院，重慶 400716）

HPLC-Q-TOF-MS-MS測定桑椹中多酚類物質

李辰辰，陸小騰駕，童華榮*

（西南大學食品科學學院，重慶 400716）

采用高效液相色譜與四極桿飛行時間串聯質譜（high performance liquid chromatography of quadrupole time of fl ight-tandem mass spectrometry，HPLC-Q-TOF-MS-MS）聯用技術定性檢測桑椹中多酚類物質，新鮮桑椹樣品經體積分數80%丙酮溶液超聲輔助提取15 min后，采用C18固相萃取小柱分離純化，純化后的樣品進行質譜鑒定。采用HPLC-Q-TOF-MS-MS對多酚進行分析：初步鑒定了桑椹中存在14 種多酚類物質，主要以酚酸、花色苷和黃酮的形式存在。其中6 種酚酸：3-O-咖啡?？鼘幩?、4-O-咖啡?？鼘幩?、二聚綠原酸、二聚4-O-咖啡酰奎寧酸、綠原酸順式異構體、3,5-O-二咖啡?；鼘幩?。4 種花色苷：飛燕草-3-半乳糖苷、飛燕草-3-葡萄糖苷、矢車菊-3-葡萄糖苷、矢車菊-3-蕓香糖苷；3 種黃酮：蘆丁、鞣花酸己糖苷和槲皮素3-O-（6’-O-丙二酰）葡萄糖苷，1 種白藜蘆醇衍生物。HPLC-Q-TOF-MS-MS可以鑒定出桑椹的多酚類物質。

桑葚；多酚；高效液相色譜；四極桿飛行時間質譜

桑椹又名桑果、桑葚、桑棗、桑實、葚子、烏葚等，為?？坡淙~喬木桑樹（Morus alba Linn.）的果實[1]，其含有大量游離酸和18 種氨基酸，此外還含有人體缺少的鋅、鐵、鈣、錳等礦物質和微量元素，以及胡蘿卜素、果糖、葡萄糖、丁二酸果膠、纖維素等，并含有果膠、無機鹽類和紫紅色色素等，各營養成分含量顯著高于常見水果[2]。研究表明，桑椹中含有較多的多酚類物質，多酚類物質是植物的次生代謝產物[3]，其不僅具有抗氧化、抗自由基、抑制低密度脂蛋白的氧化以及預防心血管疾病的作用，還具有抗癌、抗炎癥和抗血小板凝聚等功能[4-6]。鄧義書[7]研究桑椹果渣中含有的多酚類化合物的功能活性，發現其具有很強的抗氧化活性及抑菌功能。

近年來，國內對桑椹多酚的研究主要集中在對桑椹總多酚的提取及含量測定，其中紫外分光光度法[8]最為廣泛，桑椹多酚類物質的定性鑒定則多采用高效液相色譜技術[9]，高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜（high performance liquid chromatography of quadrupole time offlight-tandem mass spectrometry，HPLC-Q-TOF-MSMS）聯用技術是近年來發展起來的一項新的天然產物有效成分定性定量分析技術，可以在缺少對照品的情況下對粗提物中微量成分進行結構分析，具有高效快速，靈敏度高的優點[10-14]，本研究利用HPLC-Q-TOFMS-MS聯用技術對桑椹的多酚類化合物進行定性分析，得到精確的相對分子質量和分子的碎片信息，結合文獻資料推斷出桑椹多酚的結構，實現了對桑椹多酚類化合物的定性分析，為開發利用這一豐富的自然資源提供一定的參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桑椹鮮果，采摘于重慶市桑蠶科技園，重慶蠶科院黃傳書老師鑒定為?？坡淙~喬木桑樹的果實。樣品采集時間為2012年4月。樣品分裝后在—40 ℃冷凍貯藏。

丙酮、甲醇、乙醇、乙酸乙酯（均為分析純）成都市科龍化工試劑廠；氮氣、甲酸、乙腈（均為色譜純） 德國Merck公司。

1.2 儀器與設備

KQ3200DB型數控超聲波清洗儀 昆山市超聲儀器有限公司；ETC-H6超低溫冰箱 青島海爾特種電器有限公司；HWS-26恒溫水浴鍋、DHG-9140恒溫鼓風干燥箱 上海齊欣科學儀器有限公司；RE-5296旋轉蒸發器上海亞榮生化儀器廠；E1001固相萃取裝置 美國Waters公司；1200高效液相色譜儀（連接有二元泵、微型真空脫氣機、自動進樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器、G6540A MS Q-TOF質譜檢測器） 美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品提取

在放置桑椹鮮果的—40 ℃冰箱中取約60 g桑椹，放入打漿機中，打漿1～2 min成勻漿，備用。取5 g桑椹勻漿于100 mL燒杯中，加入體積分數80%丙酮溶液50 mL置于超聲波清洗器中，設定超聲功率150 W、提取溫度25 ℃、提取時間15min，于45 ℃條件下旋轉濃縮至近干后，用水定容于25 mL棕色容量瓶中，待純化。

1.3.2 樣品純化

參照Sun等[15]方法處理Supelco C18小柱（3 mL、500 mg），先用6 mL甲醇，6 mL水活化，再用乙酸乙酯-丙酮（4∶1，V/V）混合溶液洗脫。用0.45 μm濾膜過濾，得濾液。上樣2 mL，用6 mL水淋洗，6 mL乙酸乙酯-丙酮溶液洗脫，收集洗脫液。將洗脫液于氮吹儀中40 ℃吹干，而后用甲醇定容于10 mL棕色容量瓶中，過0.45 μm有機濾膜，備用。

1.3.3 儀器分析條件

1.3.3.1 色譜分析條件

色譜柱：ZORBAX SB C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：A為2%甲酸，B為100%乙腈；梯度洗脫：0～5 min，9% B；5～25 min，9～11.5% B；25～30 min，11.5%～25% B；30～45 min，25%～31% B；45～46 min，31%～9% B；46～50 min，9% B；流速0.7 mL/min；進樣量5 μL；柱溫35 ℃；色譜數據在220～600 nm波長范圍內掃描，檢測波長214、280、320、524 nm。

1.3.3.2 質譜分析條件

一級質譜條件：將1200高效液相色譜儀中色譜柱流出液，用T-型分流器（分流比1∶3）引入G6540A MS Q-TOF質譜檢測器。

電噴霧離子源；MS電噴霧離子化負離子模式；掃描范圍100～1 200 u；掃描速率1.00 mL/min；干燥氣（N2）流速8.0 L/min；干燥氣溫度360 ℃；噴霧氣壓力35 psi；毛細管電壓3000 V；碎裂器電壓100 V。

二級質譜條件：質量掃描范圍50～800 u；碰撞能量根據一級質譜所得化合物相對分子質量設定8～30 eV。

2 結果與分析

2.1 主要色譜峰的鑒定

按1.3節方法得到桑椹多酚主要色譜圖（圖1），桑椹中多酚類物質能夠得到分離。通過一級質譜信息、二級質譜信息及光譜信息與文獻報道比較進行鑒定，結果見表1。

表 1 桑椹分離純化樣中鑒定的多酚化合物的質譜數據Table 1 Identifi cation of phenolic compounds isolated and purified from mulberry samples

2.2 桑椹多酚的鑒定

A2和A3保留時間分別為3.736 min和4.562 min，相對分子質量為191.1的檸檬酸標品準分子離子保留時間分別為3.821 min和4.543 min，再將子離子碎片進行比對，發現檸檬酸標品進行子離子掃描也得到m/z為111的子離子碎片，與檸檬酸標準品一致，因此可以判斷A2和A3為檸檬酸。但是出現2 個檸檬酸峰A2和A3的原因還不清楚。

A4碎片離子m/z為191.1是奎寧酸192.1在質譜負模式條件下失去了一個質量數為1的氫離子碎片而得，碎片離子m/z為179是由咖啡酸在質譜負模式條件下失去了一個質量數為1的氫離子碎片而得，準分子離子m/z 353.1=192.1+180—18—1。3 個子離子碎片與Clifford等[16]報道的一致，因此判斷A4為3-O-咖啡?？鼘幩?。

A5碎片離子m/z為303為花青素苷元飛燕草花色苷產生的離子碎片飛燕草色素，準分子離子m/z 465.10—303=162.10，是由分子離子失去了一個質量數為162.1的中性碎片（脫水葡萄糖）而得。子離子碎片與Kammerer等[17]報道的一致，因此判斷A5是飛燕草-3-半乳糖苷。

A6中碎片離子m/z為173是奎寧酸在質譜負模式條件下失去了一個質量數為18的水和質量數為1的氫離子碎片而得，碎片離子m/z為179是咖啡酸在質譜負模式條件下失去了一個質量數為1的氫離子碎片而得，準分子離子m/z 353.1=192.1—18—1+180。3 個子離子碎片與Clifford等[16]報道的一致，因此判斷A6為4-O-咖啡?？鼘幩幔?-CQA）。

A7中碎片離子m/z為303為花青素苷元飛燕草花色苷產生的離子碎片飛燕草色素，m/z=465.10—303=162.10，是分子離子失去了一個質量數為162的中性碎片（脫水葡萄糖）而得。子離子碎片與Wu等[18]報道的一致，因此判斷A7為飛燕草-3-葡萄糖苷。

A8碎片離子m/z為353是咖啡酰奎寧酸354在質譜負模式條件下失去了一個質量數為1的氫離子碎片，碎片離子m/z為191是奎寧酸192在質譜負模式條件下失去了一個質量數為1的氫離子碎片。m/z為707.2的母離子可能是2 個咖啡酰奎寧酸通過加聚反應得到。因此判斷A8可能為二聚咖啡?？鼘幩?。

A9碎片離子m/z為353是咖啡酰奎寧酸354在質譜負模式條件下失去了一個質量數為1的氫離子碎片，碎片離子m/z為191是奎寧酸192在質譜負模式條件下失去了一個質量數為1的氫離子碎片，碎片離子m/z為179是咖啡酸180在質譜負模式條件下失去了一個質量數為1的氫離子碎片，碎片離子m/z=173是奎寧酸192在質譜負模式條件下失去了一個質量數為18的水和質量數為1的氫離子碎片。m/z為707.2的母離子可能由2個4-O-咖啡酰奎寧酸通過加聚反應得到。因此判斷A9可能為二聚4-O-咖啡?？鼘幩帷?/p>

A10中碎片離子m/z為285為花青素苷元矢車菊花色苷產生的離子碎片矢車菊色素，m/z=447.10—285=162.10，是分子離子失去了一個質量數為162的中性碎片（脫水葡萄糖）而得。子離子碎片與王衛東等[19]報道的一致，因此判斷A10為矢車菊-3-葡萄糖苷。

A11中碎片離子m/z為191是奎寧酸192在質譜負模式條件下失去了一個量數為1的氫離子碎片。根據Iranjan等[20]的報道這個物質可能為5-O-咖啡?？鼘幩峒淳G原酸，但是根據Weisz等[21]的報道5-O-咖啡酰奎寧酸出峰順序介于3-O-咖啡?？鼘幩岷?-O-咖啡?？鼘幩嶂g，并且綠原酸標準品的保留時間在16.442min，所以不能判斷為綠原酸。根據Kammerer等[22]的報道，準分子離子以及碎片離子也完全符合，可以判斷A11為綠原酸順式異構體。

A12中碎片離子m/z為227是白藜蘆醇228在質譜負模式條件下失去了一個質量數為1的氫離子碎片，因此A12可能為白藜蘆醇的某種衍生物[23]。

A13中碎片離子m/z為308（蘆丁苷元）=609.1—301.1，HPLC檢測標準品蘆丁相對分子質量為609.1，準分子離子保留時間為33.541 min，再將子離子碎片進行比對，發現蘆丁標準品進行子離子掃描也得到m/z為301的子離子碎片，因此可以判斷A13是蘆丁。

A14中碎片離子m/z為301是鞣花酸在質譜負模式條件下失去了一個質量數為1的氫離子碎片而得，m/z=463.10—301=162.10，是分子離子失去了一個質量數為162的中性碎片（脫水葡萄糖）而得。3 個子離子碎片與Mousavinejad等[24]的報道一致，因此判斷A14為鞣花酸己糖苷。

A15中碎片離子m/z為301的子離子碎片為槲皮素302在質譜負模式條件下失去了一個質量數為1的氫離子碎片而得。2 個子離子碎片與Arapitsas[25]的報道一致，因此判斷A15為槲皮素3-O-（6’-O-丙二酰）葡萄糖苷。

A16中碎片離子m/z為353是咖啡?？鼘幩?54在質譜負模式條件下失去一個質量數為1的氫離子碎片，碎片離子m/z為191是奎寧酸192在質譜負模式條件下失去了一個質量數為1的氫離子碎片，碎片離子m/z為180是咖啡酸180在質譜負模式條件下失去了一個質量數為1的氫離子碎片，3 個子離子碎片與Weisz等[19]的報道一致，因此判斷A16為3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸。

3 結 論

對桑椹中的多酚進行定性分析，將進行分離純化后的樣品進行Q-TOF負模式質譜分析，結果發現：桑椹中存在13 種多酚類物質，主要以酚酸、花色苷和黃酮的形式存在。其中6 種酚酸都是由咖啡酸和奎寧酸2 種基本基團以一定的方式結合而成，并且發現桑椹中的綠原酸是以順式異構體的形式存在的，3 種花色苷是由2 種花色素飛燕草素和矢車菊素與六碳糖以糖苷鍵結合產生，3 種黃酮類多酚蘆丁、鞣花酸己糖苷和槲皮素3-O-（6’-O-丙二酰）葡萄糖苷，還有一個白藜蘆醇衍生物。本實驗對桑椹中多酚類物質進行質譜定性分析，可為桑椹的進一步深入研究和開發提供參考。

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Analysis of Phenolic Compounds in Mulberry by High Performance Liquid Chromatography-Time of Flight Mass Spectrometry

LI Chenchen, LU Xiaotengjia, TONG Huarong*
(College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400716, China)

High performance liquid chromatography (HPLC)-time of flight mass spectrometry (TOF) was used to qualitatively determine the phenolic compounds of mulberry. It was found that using acetone-distilled water (4:1, V/V) as the extraction solvent, ultrasonic extraction for 15 min was the optimal extraction method. Solid-phase extraction using a C18cartridge was effective for isolating polyphenols from sugars and amino acids, which facilitated the subsequent identification by mass spectrometry. A total of 14 polyphenols in mulberry were found mainly in the forms of phenolic acids, anthocyanin and fl avonoids, including six phenolic acids, 3-O-caffeoylquinic acid, 4-O-caffeoylquinic acid, chlorogenic acid dimer, 4-O-caffeoylquinic acid dimer, cis-iso-isomers chlorogenic acid, and 3,5-di-O-caffeoyl quinic acid; four anthocyanins, prodelphinidin-3-galactosidase, prodelphinidin-3-glucoside, cyaniding-3-glucoside, and cyaniding-3-rutinoside; three fl avonoids, rutin, ellagic acid hexyl glycoside, and quercetin 3-O-(6’-O-malonyl) glycoside; as well as one resveratrol derivative.

mulberry; phenolic compounds; high performance liquid chromatography; quadrupole time of flight-mass spectrometry (Q-TOF-MS)

TS207.3

A

1002-6630（2015）02-0101-04

10.7506/spkx1002-6630-201502019

2014-06-25

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAD33B00）

李辰辰（1990—），女，碩士研究生，研究方向為食品安全與質量控制。E-mail：1052416235@qq.com

*通信作者：童華榮（1964—），男，教授，博士，研究方向為食品質量與安全、茶葉化學與生物化學。E-mail：huart@swu.edu.cn