腎陽虛、腎陰虛證大鼠模型的建立與穩定性觀察

張子怡，陳寶軍，張英杰，王雯婷，王藝茹，蘇友新

（福建中醫藥大學，福建 福州 350122）

中醫證候動物模型的建立與研究是連接中醫基礎和臨床的樞紐，是深化對證候實質認識的重要方法之一，同時也是篩選有效中藥、藥物作用機制深入研究的關鍵手段之一。所以，尋找既符合中醫學理論，又真實反映臨床證候特征，且具有較好穩定性和重復性的動物模型以滿足中醫藥研究的需求，是中醫證候動物模型研究的重要任務［1］。大量外源性腎上腺皮質激素的補充可抑制體內促腎上腺皮質激素的釋放，進而反饋使得內源性類固醇激素分泌減少，當停止外源腎上腺皮質激素補充時，會出現一系列與臨床腎陽虛證候患者類似的癥狀、體征；而利用甲狀腺素可提高動物的基礎代謝率，引起全身性因代謝影響而出現與腎陰虛證候相似的表現。本實驗在前人研究的基礎上，選擇較為經典且應用最多的肌注氫化可的松及灌胃甲狀腺片的方法分別復制腎陽虛、腎陰虛證候大鼠模型，并在造模結束后繼續觀察3周，以獲得既符合腎陽虛、腎陰虛證候特征，又具有較穩定表現的、簡便可行的動物模型，為中醫腎陽虛、腎陰虛證本質的研究提供可靠、穩定的證候動物模型。現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 健康3月齡SPF級WISTAR大鼠 90 只，均為雄性，體質量（210±20）g，由上海斯萊克實驗動物有限公司提供，動物許可證號：SCXK（滬）2012-0002，質量合格證編號：2007000548015。采用隨機數字表法將大鼠分為3組，即正常組、腎陽虛組及腎陰虛組各30只。

1.2 試劑及藥物 大鼠環磷酸腺苷（cAMP）及大鼠環磷酸鳥苷（cGMP）ELISA試劑盒（上海Westang Bio-tech有限公司）；甲狀腺片（山東省萊陽生物化學制藥廠，國藥準字：H37020075，產品批號：110805）；氫化可的松注射液 （福州海王福藥制藥有限公司，國藥準字：H35020193，產品批號：1209111）。

1.3 主要儀器 電子體溫計（FT-A21CN型，深圳市貝利斯科技發展有限公司）；酶聯免疫檢測儀（ELX808型，美國BIO-TEK）；電子天平（YP202N型，上海精密科學儀器有限公司）；離心機（64R型，美國BECKMAN公司）。

1.4 實驗方法

1.4.1 甲狀腺片混懸液的制備 將甲狀腺片置研磨器中研磨成粉末，然后用無菌生理鹽水溶解混勻，制成40 mg／mL的甲狀腺片混懸液，4℃冰箱保存，使用前搖勻。

1.4.2 模型造模方法

1.4.2.1 腎陽虛證大鼠模型 臀部肌肉注射氫化可的松注射液（2.5 mg／100 g），每日 1 次，自由飲水、飲食，連續 15 d［2］。

1.4.2.2 腎陰虛證大鼠模型 灌胃甲狀腺片混懸液（45 mg／100 g），每日 1 次，自由飲水、飲食，連續15 d［3］。

1.4.3 模型鑒定方法

1.4.3.1 大鼠血清cAMP、cGMP含量的檢測 ①造模結束時首次檢測：取正常組、腎陽虛組、腎陰虛組大鼠，吸入乙醚麻醉后，用左手拇指及食指輕輕壓迫動物的頸部兩側，使眶后靜脈叢充血、眼球充分外突，右手持毛細玻璃采血管進行眼眶后靜脈叢采血 1～1.5 mL。 4℃冰箱放置 4 h后，2000 r／min離心10 min取上清，使用cAMP和cGMP ELISA試劑盒檢測大鼠血清中cAMP、cGMP含量，具體步驟參考cAMP和cGMP ELISA試劑盒操作說明書。②造模結束后3周再次檢測：取正常組、腎陽虛組、腎陰虛組大鼠，用10%水合氯醛以300 mg／kg的劑量腹腔注射麻醉大鼠，常規備皮，取腹部正中入路打開腹腔，抽取腹主動脈血液。血液標本處理及檢測方法同“造模結束時首次檢測”。

1.4.3.2 大鼠體重及體溫的檢測 于造模首日、造模結束時及造模結束3周后的上午9點，分別測定3組大鼠的體重、體溫。① 體重檢測：將大鼠逐一放在電子天平上測量體重并記錄。② 體溫檢測：待大鼠排便完全后，左手固定大鼠，右手將電子體溫計蘸上甘油后緩慢插入肛門，至電子體溫計發出體溫穩定提示音即可，讀取體溫并記錄。

1.4.3.3 腎陽虛證大鼠模型 ① 一般狀態［2，4］：與正常組大鼠比較，模型大鼠出現體重增長緩慢且低于腎陰虛組大鼠，體溫下降，活動減少，反應遲鈍，蜷縮弓背，畏寒怕冷，體毛枯疏并失去光澤等陽虛的表現。②環核苷酸系統的變化：與正常組大鼠比較，模型大鼠血清cGMP含量上升，cAMP含量下降，cAMP ／cGMP 比值降低［4］。

1.4.3.4 腎陰虛證大鼠模型 ① 一般狀態［5］：與正常組大鼠比較，模型大鼠出現躁動、易驚、怕人等表現，體重增長較正常組大鼠緩慢。② 環核苷酸系統的變化：與正常組大鼠比較，模型大鼠血清cAMP含量上升，cAMP ／cGMP 比值升高［4］。

1.4.4 大鼠模型穩定性觀察 造模結束后，正常飼養大鼠，繼續觀察3周，通過肉眼觀察大鼠活動、反應及弓背情況，毛發、爪甲顏色變化等方面，并測量大鼠體重與體溫（肛溫），比較造模結束時和造模結束后3周所檢測大鼠血清cAMP、cGMP的含量，判斷腎陽虛、腎陰虛模型大鼠表現的穩定性。

1.4.5 統計學處理 采用SPSS 17.0軟件進行統計學分析，所得數據用（±s）表示。組內比較采用配對t檢驗和秩和檢驗，組間比較采用單因素方差分析和LSD檢驗。P＜0.05有顯著性差異。

2 結 果

2.1 大鼠一般狀態的觀察與比較 造模后，與正常組大鼠比較，腎陽虛組大鼠出現爪甲與耳朵顏色變淡；腎陰虛組大鼠爪甲與耳朵顏色無明顯變化，見圖1。造模后，與正常組大鼠比較，腎陽虛組大鼠出現活動減少、反應遲鈍、弓背蜷縮、喜扎堆等畏寒怕冷表現；腎陰虛組大鼠出現躁動、易驚、怕人等表現，見圖2。

圖1 3組大鼠爪甲與耳朵顏色變化情況比較

圖2 3組大鼠活動及弓背等情況比較

2.2 3組大鼠體重比較 見表1。

表1 3組大鼠體重比較（±s）g

表1 3組大鼠體重比較（±s）g

注：與造模前比較，1） P＜0.01；與造模結束時比較，2） P＜0.01；與正常組比較，3） P＜0.01；與腎陰虛組比較，4） P＜0.05，5）P＜0.01。

組別正常組腎陽虛組腎陰虛組n 302730造模前254.10±14.69253.93±15.50250.57±15.88造模結束時305.67±18.351）267.48±15.531）3）4）277.03±13.501）3）造模結束后3周371.90±18.561）2）290.63±14.591）2）3）5）312.26±20.751）2）3）

2.3 3組大鼠體溫比較 見表2。

表2 3組大鼠體溫（肛溫）比較（±s） ℃

表2 3組大鼠體溫（肛溫）比較（±s） ℃

注：與正常組比較，1） P＜0.01，2） P＜0.05；與腎陰虛組比較，3） P＜0.01；與造模前比較，4） P＜0.01。

組別正常組腎陽虛組腎陰虛組n 302730造模前38.12±0.3038.11±0.3938.12±0.24造模結束時38.13±0.3337.17±0.371）3）4）38.33±0.252）4）造模結束后3周38.13±0.3437.33±0.311）3）4）38.34±0.232）4）

2.43組大鼠血清cAMP、cGMP含量比較 見表3。

3 討 論

動物實驗研究是當代醫藥學研究的重要方式。無論是基礎研究還是應用研究，動物模型已經成為研究的一種重要工具［6］。借助于腎陽虛、腎陰虛證動物模型探討腎虛證實質是一種可行的研究思路，是中醫證候實質研究的重要手段之一。腎陽虛造模方法多樣［7-9］，主要包括有如氫化可的松、腺嘌呤、羥基脲及抗甲狀腺等藥物造模，切除睪丸、腎上腺及甲狀腺等手術造模和根據中醫病因“恐傷腎”、房勞傷腎等三大類造模方法。其中以氫化可的松造模法最為常見，模型在病理方面與腎陽虛證實質基本一致，其癥狀、體征也較符合腎陽虛證的臨床表現。相較于手術模型，此法對于動物創傷小，不會造成不可逆性傷害，方便后續研究；與根據中醫病因制作的模型比較，氫化可的松造模操作簡便，可控性高，可重復性好。所以我們選取注射氫化可的松制作腎陽虛動物模型。腎陰虛造模方法包括有灌服甲狀腺素，注射過量的促腎上腺皮質激素，采用手術結扎一側實驗動物腎動脈，服用大劑量熱性中藥如附子、肉桂等［10-11］。基于臨床上甲狀腺功能亢進患者日久多數出現腎陰虛證候，故灌服甲狀腺素可通過升高外源性甲狀腺素水平從而復制腎陰虛動物模型，且此造模方法已被廣泛采用。注射過量促腎上腺皮質激素雖可使動物出現一系列陰虛癥狀，但突然停用又可出現陽虛表現；手術結扎腎動脈法則對動物會造成一定創傷，模型與預模擬的臨床病理表現有一定差距；而服用熱性中藥造模法在實驗研究中較少應用。因此我們選擇灌服甲狀腺素方法復制腎陰虛證動物模型［12］。

表3 3組大鼠 cAMP、cGMP 含量比較（±s）

表3 3組大鼠 cAMP、cGMP 含量比較（±s）

注：與正常組比較，1） P＜0.01。

組別正常組腎陽虛組腎陰虛組n 302730 cAMP／（pmol／mL）36.14±5.0923.17±4.801）75.50±6.521）造模結束時cGMP／（pmol／mL）8.80±3.4626.56±3.171）8.86±3.25 cAMP／cGMP 4.69±1.700.88±0.201）9.69±3.431）造模結束后3周cAMP ／（pmol／mL）36.95±3.8123.64±2.951）74.46±4.421）cGMP／（pmol／mL）8.06±0.9626.16±2.741）8.00±1.16 cAMP／cGMP 4.66±0.780.92±0.171）9.51±1.561）

目前關于腎陽虛、腎陰虛證動物模型的鑒定方法眾多，還沒有統一的標準。根據臨床腎虛證患者的表現，研究中動物模型的癥狀與體征，如體溫、體重、毛色、弓背、活動情況、采食量及飲水量等，常被作為腎陽虛、腎陰虛的判斷指標之一［13］，因為腎陽為人體陽氣之根本，又被稱為命門之火，是人體生命活動的原動力，具有蒸騰、推動、溫煦及固攝等生理功能，能夠促進機體新陳代謝，增強臟腑組織器官的功能活動，制約體內陰寒之氣等，故當機體腎陽虛弱時往往表現出新陳代謝緩慢、組織器官功能減弱以及體內寒涼之象；腎陰為全身陰液之根本，具有滋潤及制約陽熱等生理功能，故當腎陰虧虛時往往表現出一派陰虛火旺之象。另外，有關指標的檢測也是作為鑒定腎虛證模型的條件，其中cAMP、cGMP含量的檢測及cAMP／cGMP比值的計算是目前最常用的腎陽虛、腎陰虛證動物模型可量化鑒定方法之一。王培源等［14］經過多年研究，結果顯示測定血漿cAMP、cGMP含量及其比值，可以作為幫助判斷腎陰虛、腎陽虛的一個客觀指標。美國生物學家Goldberg在上世紀70年代初曾提出細胞功能調節的“陰陽學說”，認為cAMP與cGMP拮抗性作用與中醫的“陰陽”相類似。因此，本實驗采用觀察模型動物的相關狀態及檢測cAMP、cGMP含量和計算cAMP／cGMP比值作為腎陽虛、腎陰虛證動物模型的鑒定方法是可行的。

本實驗觀察到腎陽虛組大鼠造模后出現活動減少，反應遲鈍，體毛枯疏并失去光澤，爪甲與耳朵顏色變淡，弓背蜷縮，喜扎堆等畏寒怕冷表現，提示大鼠體內新陳代謝減慢、組織器官功能減弱且體內一派寒涼之象，其表現與臨床腎陽虛證患者類似；腎陰虛組大鼠出現躁動、易驚、怕人等表現，提示大鼠的狀態表現與臨床腎陰虛證患者的陰虛火旺之象類似。與正常組大鼠比較，腎陽虛和腎陰虛組大鼠體重均低于正常組（P＜0.01），腎陽虛組大鼠體溫顯著下降（P＜0.01），腎陰虛組大鼠體溫升高（P＜0.05）。通過檢測大鼠血清 cAMP、cGMP含量及cAMP／cGMP的比值計算結果顯示，腎陽虛組大鼠cAMP含量下降 （P＜0.01），cGMP含量顯著升高及cAMP／cGMP 比值顯著降低（P＜0.01）；腎陰虛組大鼠血清cAMP含量及cAMP／cGMP比值均顯著升高（P＜0.01）。上述腎陽虛、腎陰虛組大鼠的狀態表現與血清cAMP、cGMP含量檢測及cAMP／cGMP比值結果與茍小軍等［2］的研究結果是相符的，提示本實驗腎陽虛、腎陰虛證模型大鼠造模是成功的。造模結束后3周，發現腎陽虛與腎陰虛組大鼠在活動、反應、毛色及體溫、體重等方面仍然具有較穩定的表現，且大鼠血清cAMP、cGMP含量及cAMP／cGMP的比值計算結果仍提示本實驗動物模型為腎陽虛與腎陰虛證，說明腎陽虛、腎陰虛大鼠模型在造模后3周其證候表現依然穩定。總之，本實驗所建立的腎陽虛證模型與腎陰虛證模型大鼠的癥狀、體征和血清cAMP、cGMP含量檢測及cAMP／cGMP比值結果均符合腎陽虛、腎陰虛證模型的鑒定要求，造模結束后3周所記錄下的大鼠的癥狀、體征和血清cAMP、cGMP含量檢測及cAMP／cGMP比值結果均符合腎虛證模型的鑒定指標。

本實驗結果表明，注射氫化可的松和灌服甲狀腺素分別引起的大鼠相關癥狀、體征及環核苷酸系統的變化，分別與臨床腎陽虛證、腎陰虛證的表現吻合，且造模結束后3周模型依舊保持穩定，提示此法建立的腎陽虛、腎陰虛證模型是確實可靠且相對穩定的，說明該方法是構建腎陽虛、腎陰虛證動物模型的理想方法。

［1］林志健，張冰，劉小青，等.中醫證候動物模型評價研究［J］.中華中醫藥雜志，2013，28（8）：2217-2219.

［2］茍小軍，韓寶俠，王朝廷，等.腎陽虛證造模方法考察［J］.吉林中醫藥，2009，29（9）：814-815.

［3］梁汝圣，徐宗佩.大鼠腎陰陽虛模型建立方法［J］.吉林中醫藥，2008，28（9）：685-687.

［4］杜江，李楠，王和鳴.腎虛模型造模方法及相關指標［J］.中國組織工程研究與臨床康復，2010，14（50）：9433-9436.

［5］王培源，劉蓬，黃燕曉.腎陰虛豚鼠模型的建立及對內耳形態學影響的實驗研究［J］. 遼寧中醫藥大學學報，2006，8（4）：135-137.

［6］呂愛平.病證結合動物模型研究：從理論創新到技術挑戰［J］.中國中西醫結合雜志，2013，33（1）：6-7.

［7］周文江，姚菊芳，彭秀華，等.腎陽虛證大鼠模型的建立［J］.實驗動物與比較醫學，2007，27（4）：242-243.

［8］盧德趙，沃興德，沃立科，等.甲狀腺切除的腎陽虛大鼠肝線粒體蛋白質組的研究［J］.中醫藥學報，2008，36（4）：11-15.

［9］張丹，李哲，朱慶均，等.“勞倦過度、房室不節”腎陽虛小鼠模型的建立及評價［J］.實驗動物科學，2008，25（4）：9-11.

［10］王萍，王喜軍.腎陰虛證動物模型研究概況［J］.中醫藥信息，2013，30（4）：123-125.

［11］王丹，田付華.腎陰虛證研究概況［J］.遼寧中醫藥大學學報，2008，10（4）：33-35.

［12］付曉伶，方肇勤.陰虛證動物模型的造模方法及評析［J］.上海中醫藥大學學報，2004，18（2）：51-54.

［13］陳奇.中藥藥理研究方法學［M］.2版.北京：人民衛生出版社，2006：1035-1037.

［14］王培源，劉蓬，黃燕曉.腎陰虛豚鼠模型的建立及對內耳形態學影響的實驗研究［J］. 遼寧中醫藥大學學報，2006，8（4）：135-137.