核轉錄因子和明膠酶在鼻息肉中的表達及臨床意義

孫樹軍，趙立民，殷憲寶

（1.濰坊醫學院附屬醫院耳鼻咽喉頭頸外科，山東 濰坊 261030；2.山東省棗莊市立醫院耳鼻咽喉科，山東 棗莊 277000）

·臨床論著·

核轉錄因子和明膠酶在鼻息肉中的表達及臨床意義

孫樹軍1，趙立民1，殷憲寶2

（1.濰坊醫學院附屬醫院耳鼻咽喉頭頸外科，山東 濰坊 261030；2.山東省棗莊市立醫院耳鼻咽喉科，山東 棗莊 277000）

目的觀察核轉錄因子（p-STAT3）及明膠酶（MMPs）在鼻息肉組織中的表達情況，探討兩者在鼻息肉發病過程中的作用及相互關系，為鼻息肉的臨床治療提供幫助和新的思路。方法收集濰坊醫學院附屬醫院耳鼻喉科2008年5月-2013年4月期間行鼻內鏡手術的患者45例（鼻息肉組35例，下鼻甲黏膜組10例），采用常規病理和免疫組織化學方法檢測p-STAT3和MMP-2、9在鼻息肉及下鼻甲組織中的表達情況。結果MMP-2、9在鼻息肉組和下鼻甲黏膜組的表達分別為68.6%（24/35）、20%（2/10)；82.9%（29/35）、20%（2/10），鼻息肉組與下鼻甲黏膜組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。p-STAT3在鼻息肉及下鼻甲黏膜組的陽性表達率為71.4%（25/35）、0.0%，兩者比較差異有統計學意義（P＜0.05)。P-STAT3和MMP-2、9存在著正相關關系（r =0.278，r=0.312，P＜0.05）。結論p-STAT3和MMP-2、9在鼻息肉組織的高表達和正相關性說明兩者在鼻息肉的發病過程中起著重要作用，可作為臨床治療鼻息肉病的檢測指標之一。

STAT3；MMP-2、9；鼻息肉；免疫組織化學

鼻息肉是多種原因導致的鼻腔及鼻竇慢性炎癥性疾病，鼻息肉的主要組織病理特征是上皮下水腫和炎癥細胞浸潤，而且伴隨上皮層的增生、纖維化和基底膜的增厚。這些特征性改變需要多種因素結合才能完成，Th淋巴細胞，尤其是Th17細胞在鼻息肉的發病過程中扮演了重要的角色，對于多種細胞因子聯系過程和鼻息肉的發病機制現在不是很明確[1]。

細胞外基質有過多的細胞集聚是鼻息肉組織形成的基礎。細胞外基質組成基底膜，并且包繞和支持黏膜細胞，細胞外基質（extracellular matrixc，ECM）的合成和降解對于細胞的平衡非常重要。核轉錄因子STAT3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）在胞外信號的作用下其酪氨酸基團被JAK（Janus Kinase，JAK）磷酸化，以二聚體的形式進入胞核內，與胞核中特異的基因片段相結合，調節下游基因及相關蛋白的表達。并在IL-6的刺激下參與Th17細胞的增殖活化，由STAT3介導下引起的Th17細胞反應在哮喘等免疫及炎癥性疾病的發病中發揮關鍵作用[2]。

本研究從這點出發通過收集相關的臨床標本，采用免疫組織化學方法，檢測p-STAT3及明膠酶（matrix metalloproteinases，MMPs）在鼻息肉中的表達，初步探討它們在鼻息肉發生發展中的作用和機制，并分析它們之間的關系。

1 資料與方法

1.1臨床資料

收集2008年5月-2013年4月期間在濰坊醫學院附屬醫院耳鼻咽喉科住院期間行鼻內鏡手術的患者，共45例。其中鼻息肉組35例，男26例，女9例，年齡20～55歲，平均38歲；下鼻甲組10例，男8例，女2例，年齡17～42歲，平均32歲。所有患者無變應性鼻炎、哮喘等病史，無服用類固醇皮質激素、抗組胺藥物等病史。按照中華醫學會耳鼻喉科學分會關于慢性鼻竇炎鼻息肉臨床分型分期及內窺鏡鼻竇手術療效評定標準（1997年，海口）分型，鼻息肉組其中Ⅱ型1期9例，Ⅱ型2期18例，Ⅱ型3期3例，Ⅲ型5例。對照組（下鼻甲黏膜組）：均為慢性肥厚型鼻炎有雙側下鼻甲肥大患者。見表1。

1.2儀器及試劑

主要儀器：切片機、電熱恒溫培養箱、全自動顯微照相系統、電子顯微鏡、病理組織包埋機等。主要試劑：鼠抗人STAT3多克隆抗體、鼠抗人MMP-2、9多克隆抗體、免疫組織化學染色試劑盒（SP-6000）、DAB顯色試劑盒等均來自北京中山生物有限公司。

1.3方法

術中收集標本中性福爾馬林固定，進行常規病理檢查。免疫組織化學采用SP法按照說明書進行。將待用的石蠟切片取出后置于60℃的烤箱內烤片，常規脫蠟入水，用PBS沖洗切片；抗原修復：修復時間為15～20 min。自然冷卻后PBS沖洗3遍；室溫孵育10 min，以阻斷內源性過氧化物酶，PBS沖洗3次；EDTA微波抗原修復，滴加非免疫性動物血清，室溫下卵育10 min，倒去血清后，滴加一抗工作液（MMP-2、9或STAT3抗體稀釋液），切片分開滴加一抗，4℃冰箱過夜，0.01 MPBS沖洗3次。同時做陰性對照，控制條件與此前相同，只是用PBS溶液替代一抗。滴加生物素化二抗PBS液沖洗5 min 3次。滴加辣根酶標記鏈酶卵白素工作液（S-A/HRP），DAB顯色，蘇木精復染。以對應的鼠抗人陰性IgG作為對照，以已知的陽性組織作為陽性對照組。

1.4結果觀察

以高倍鏡和低倍鏡分別觀察p-STAT3和MMP-2、9在鼻息肉組織中的陽性表達情況，每一切片均經2位病理醫師進行單盲法評估，并取平均值。陽性細胞以細胞質或細胞核被染成棕黃色或棕褐色為陽性細胞，采用半定量方法確定陽性結果及積分情況，在高倍鏡下隨機選取5個陽性細胞數多的視野進行結果判定及評分：陽性細胞數≥75%為4分，陽性細胞數51%～75%為3分，陽性細胞數11%～50%為2分，陽性細胞數≤10%為1分，陰性為0分。棕褐色為3分，棕黃色為2分，淡黃色為1分，不著色為0分。兩個指標相乘得分，所得結果＞3分即為陽性。把所得結果分為4個等級：陰性（-）為0～2分，（+）為3～4分，（++）為6～8分，（+++）為9～12分。

1.5統計學方法

采用SPSS 16.0統計軟件進行數據分析，所得結果用χ2檢驗和Spearman等級相關分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1STAT3表達情況

p-STAT3陽性表達主要在鼻息肉黏膜和腺體上皮細胞質，呈棕黃色和棕褐色，周圍少許細胞呈淡

黃色表達（見圖1、2）。陽性表達率為71.4%（25/35），在下鼻甲黏膜組織未見陽性表達（見圖3）。鼻息肉組中（+）5例,（++）7例,（+++）13例。鼻息肉組陽性表達率明顯高于下鼻甲組，兩者比較有統計學意義（χ2=31.96，P＜0.05）。（見表1）。

圖1 鼻息肉組織黏膜上皮STAT3表達，陽性（×400）

圖2 鼻息肉組織腺體上皮STAT3表達，陽性（×400）

圖3 正常下鼻甲黏膜STAT3表達，陰性（×400）

表1 STAT3在鼻息肉和正常下鼻甲黏膜中的表達情況

2.2明膠酶表達情況

MMP-2陽性表達主要在鼻息肉黏膜和腺體上皮細胞質，呈棕黃色、棕褐色和淡黃色表達，陽性表達率為68.6%（24/35），其中（+）10例，（++）8例，（+++）6例（見圖4）。下鼻甲組陽性表達率為20%（2/ 10）（見圖5），其中（+）2例，鼻息肉組陽性表達明顯高于下鼻甲組，兩者比較有統計學意義（χ2=7.54，P＜0.05）（見表2）；MMP-9陽性表達主要在息肉黏膜及腺體上皮細胞質中，呈棕黃色和棕褐色表達（見圖6），陽性表達率為82.9%（29/35），其中（+）7例，（++）12例，（+++）10例，下鼻甲組陽性表達率為20%（2/10），其中（+）2例，鼻息肉組陽性表達明顯高于下鼻甲組，兩者比較有統計學意義（χ2=14.36，P＜0.05）。見表3。

圖4 鼻息肉組織中腺體上皮MMP-2表達陽性（×400）

圖5 正常下鼻甲黏膜中MMP-2表達，陰性（×400）

2.3p-STAT3和MMP-2、9在鼻息肉中表達的相關性

鼻息肉組p-STAT3陽性表達25例，其中15例MMP-2陽性表達，10例陰性表達；18例MMP-9陽性表達，7例陰性表達。強陽性例數p-STAT3 20例；MMP-2 14例；MMP-9 22例。3組陽性表達雖無統計學意義但強陽性表達p-STAT3和MMP-9高于MMP-2。在p-STAT3陰性表達10例中有3例

MMP-2陽性表達、5例MMP-9陽性表達。對所有數據進行統計學分析，使用Spearman相關分析方法：p-STAT3與MMP-2之間：r=0.278，P＜0.05。P-STAT3和MMP-9之間：（r=0.312，P＜0.05），說明p-STAT3與明膠酶之間存在正相關性關系。見表4。

表2 MMP-2在鼻息肉和正常下鼻甲黏膜中的表達情況

圖6 鼻息肉組織中黏膜上皮MMP-9陽性表達（×400）

表3 MMP-9在鼻息肉和正常下鼻甲黏膜中的表達情況

表4 鼻息肉組織中MMP-2、9表達和STAT3的相關性分析

3 討論

JAK-STAT（Janus Kinase-signal transducer and activator of transcription）信號轉導途徑調節炎癥因子從而影響病變過程，在正常調節下，這種途徑有通過負反饋機制抑制炎癥反應有積極的一面。STAT3與細胞增生及分化密切相關，活化的T細胞分泌多種細胞因子與細胞表面相應受體結合，通過信號轉導通路將胞外信號轉導至胞核內，調節細胞生長。STAT3是一種重要的轉錄因子，調控許多腫瘤血管的形成、影響各種細胞周期、細胞凋亡等相關基因的表達，如明膠酶、VEGF、酪氨酸激酶Src等[3]。LINKE等[4]通過Western blot和免疫組織化學法發現鼻息肉組STAT3-mRNA水平與下鼻甲組比較無差異性，但其數量明顯高于對照組（P＜0.01），免疫組織化學發現P-STAT3主要在下鼻甲組的表淺上皮層細胞表達，在間質或上皮層基底細胞無表達情況，而鼻息肉組無論在上皮層還是間質、基底細胞層都有表達現象。STAT3在鼻息肉增殖中發揮重要作用。

筆者采取免疫組織化學方法發現p-STAT3在鼻息肉組表達明顯增強，陽性表達率71.4%，以息肉黏膜上皮和腺體上皮細胞表達為主，在下鼻甲組織上皮中無陽性表達情況，兩者比較差異有統計學意義。說明p-STAT3在鼻息肉中發揮重要作用。國內研究表明STAT3在鼻息肉中黏膜上皮及腺體的表達的陽性率為66.67%，鼻息肉組STAT3表達明顯高于下鼻甲組33.33%（P＜0.01）。p-STAT3在鼻息肉中黏膜上皮及腺體表達的陽性率為56.67%，鼻息肉組p-STAT3表達明顯高于下鼻甲組43.33%（P＜0.01）[5]。

組織重塑近年來成為研究熱點之一，細胞外基質的降解和生成是組織的重建和病理過程。鼻息肉是上呼吸道的慢性炎癥疾病，組織特點為炎癥細胞的浸潤、上皮細胞的過度分化和組織重建，而細胞外基質的增厚和水腫是導致鼻息肉形成和反復發作的基礎[6]。息肉中大量明膠酶的表達誘發基底膜膠原和明膠降解，伴隨大量微血管的增生和極有利于大分子物質如纖維蛋白原通過，隨后發生血漿外滲增多，細胞外基質蓄積，導致組織水腫，局部張力增加擠壓上皮，局部缺氧更易使上皮破裂，逐漸形成息肉[6]。

明膠酶包括MMP-2和MMP-9，能有效降解明膠和基底膜的主要成分Ⅴ、Ⅳ、Ⅹ、Ⅸ型膠原，其高表達可導致細胞外基質和血管基底膜降解加速，在多種炎癥性和腫瘤性疾病致病過程中發揮重要作用。國外研究發現在鼻息肉中MMP-9的高表達可能破壞基底膜的膠原質和上皮，導致血管通透性增加和間質水腫。在鼻內鏡鼻息肉手術后復發病例中有更多的MMP-9表達情況，說明MMP-9在鼻息肉的病理過程中發揮重要作用[6]。

該研究中明膠酶MMP-2和MMP-9在鼻息肉組織中有高表達情況，其陽性表達率分別為68.6%和82.9%，明顯高于對照組下鼻甲組表達。MMP-2陽性表達主要在鼻息肉黏膜和腺體上皮細胞質，少許在細胞核，呈棕黃色、棕褐色和淡黃色表達，其強陽性表達例數少于MMP-9，其中MMP-2強陽性表達例數為（+）10例，（++）8例，（+++）6例。MMP-9主要在息肉黏膜及腺體上皮細胞質中，呈棕黃色和棕褐色表達，強陽性表達例數（+）7例，（++）12例，（+++）10例。兩者陽性表達率及強陽性表達例數比較差異無統計學意義，但MMP-9陽性和強陽性表達例數高于MMP-2，說明MMP-9在鼻息肉組織表達敏感性高于MMP-2。陳江波等[7]研究指出MMP-9在復發組及嗜酸性粒細胞組鼻息肉的高表達，提示MMP-9可能通過增加嗜酸性粒細胞在鼻黏膜局部的浸潤，影響了鼻息肉的預后。MMP-9可能作為鼻息肉復發的危險因子之一。

STAT3是在多種細胞因子相應受體結合后，激活酪氨酸激酶，從而被其磷酸化，然后形成二聚體，再轉位至核中，與DNA上的靶基因結合，激活靶基

因的轉錄[3]。而明膠酶有可能在與p-STAT3聯系后被激活而發揮相應作用。本研究通過免疫組織化學發現p-STAT3和MMP-2、9在鼻息肉的黏膜和腺上皮中有高表達，而且明顯強于正常下鼻甲黏膜的表達。本研究發現在鼻息肉組織中p-STAT3和MMP-2、9呈正相關性，說明MMP-2、9在鼻息肉的發病過程中有重要的作用，阻斷p-STAT3的信號轉導可下調明膠酶的表達，使鼻息肉的生長減慢。因此，筆者認為抑制p-STAT3蛋白通路可能有望成為一條治療鼻息肉的新途徑。

[1]PIN ZHIR CHAO,CHI-MING CHOU,CHEN-HO CHEN.Plasma RANTES and eotaxin levels are correlated with the severity ofchronic rhinosinusitis[J].EurArchOtorhinolaryngol,2012, 269(11):2343-2348.

[2]HAKAN CINCIK,EVREN ERKUL,DOGAN PINAR,et al.E-valuation of MMP-9 and TIMP-1 levels of the patients with nasal polyposis after corticosteroid therapies[J].Indian J Otolaryngol Head Neck Surg,2013,65(Suppl 2):S445–S449.

[3]BABON JJ,KERSHAW NJ,MURPHY JM,et al.Suppression of cytokine signaling by SOCS3:characterization of the mode of inhibition and the basis of its specificity[J].Immunity,2012,36(2): 239–250.

[4]LINKE R,PRIES R,K?NNECKE M,et al.Increased activation anddifferentiatedlocalizationofnativeandphosphorylated STAT3 in nasal polyps[J].Wollenberg B.Int Arch Allergy Immunol,2013,162(4):290-298.

[5]張濤,曹慶松,王麗華.鼻息肉中STAT3和VEGF的表達與相關性研究[J].華中國病理生理雜志,2009,25(5):993-997.

[6]CHEN-YUCHIEN,CHIH-FENGTAI,WEN-REIKUO,et al.Matrix metalloproteinase-9 gene polymorphisms in nasal polyposis[J]. BMC Medical Genetics,2010,11:85-92.

[7]陳江波,王天生,孫虹.基質金屬蛋白酶-9和嗜酸粒細胞在鼻息肉組織的表達及其對預后的影響[J].臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志, 2009,23(18):840-842.

（張蕾 編輯）

Expression and clinic function of STAT3 and MMP-2 and 9 in nasal polyp tissue

Shu-jun SUN1,Li-min ZHAO1,Xian-bao YIN2
(1.Department of Otorhinolaryngology,the Affiliated Hospital of Weifang Medical University, Weifang,Shandong 261030,P.R.China;2.Department of Otorhinolaryngology,the Municipal Hospital of Zaozhuang,Zaozhuang,Shandong 277000,P.R.China)

【Objective】To observe the expression and clinical role of p-STAT3 and MMP-2 and 9 in the tissue of nasal polyps and to investigate their relationship in the development of nasal polyps so as to provide help and new ideas for clinical treatment of nasal polyps.【Methods】The expressions of p-STAT3 and MMP-2 and 9 were detected in the tissue of nasal polyps and inferior turbinate by routine pathologic and immunohistochemical methods.A total of 45 patients received nasal endoscopic surgery in the Department of Otorhinolaryngology of the Affiliated Hospital of Weifang Medical University from May 2008 to April 2013 (35 cases in nasal polyp group and 10 cases in the inferior turbinate mucosa group).【Results】The expression rates of MMP-2 and MMP-9 were 68.6%(24/35)and 82.9%(29/35)in the nasal polyp group and 20% (2/10)and 20%(2/10)in the inferior turbinate mucosa group,respectively.There was obvious difference between both groups(P＜0.05).The expression rate of p-STAT3 was 71.4%(25/35)and 0.0%in the nasal polyp group and the inferior turbinate mucosa group respectively,there was a statistical difference between both groups(P＜0.05).There were positive correlations between p-STAT3 and both MMP-2 and 9(r=0.278 and 0.312,P＜0.05).【Conclusions】The high expressions of p-STAT3 and MMP-2 and 9 in nasal polyps and positive correlations illustrate they all play important roles in the pathogenesis of nasal polyps and can be used as markers of clinical treatment for nasal polyposis.

STAT3;MMP-2;MMP-9;nasal polyp;immunohistochemistry

R765.2

A

1005-8982（2015）27-0036-05

2015-04-14