腦缺血損傷后細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2信號(hào)通路及胡黃連苷Ⅱ的干預(yù)作用

周廣正，官亞?wèn)|，張華，呂偉，付德利，翟麗

（青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合中心，山東 青島 266021）

·論著·

腦缺血損傷后細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2信號(hào)通路及胡黃連苷Ⅱ的干預(yù)作用

周廣正，官亞?wèn)|，張華，呂偉，付德利，翟麗

（青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合中心，山東 青島 266021）

目的探討胡黃連苷Ⅱ?qū)δX缺血損傷后細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（ERK1/2）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響。方法成年健康雄性Wistar大鼠90只，隨機(jī)選擇15只為對(duì)照組，其余75只應(yīng)用線栓法建立大鼠腦缺血模型，經(jīng)腹腔注射胡黃連苷Ⅱ20 mg/kg干預(yù)治療為胡黃連苷組。將成功的60只動(dòng)物模型隨機(jī)分為模型組、治療組、脂多糖（LPS）組及U0126組，每組15只。用改良神經(jīng)功能缺損評(píng)分（mNSS）評(píng)價(jià)動(dòng)物神經(jīng)行為功能，原位末端標(biāo)記法（TUNEL）檢測(cè)細(xì)胞凋亡，Western blot檢測(cè)ERK1/2表達(dá)水平。結(jié)果大鼠腦缺血損傷后出現(xiàn)神經(jīng)行為功能障礙，皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)量和pERK1/2蛋白表達(dá)較對(duì)照組明顯增多（P＜0.05）。胡黃連苷組和U0126組大鼠皮質(zhì)區(qū)凋亡細(xì)胞與pERK1/2表達(dá)較模型組明顯降低（P＜0.05），LPS組大鼠凋亡細(xì)胞與pERK1/2表達(dá)水平較高，但后期pERK1/2表達(dá)水平有所下降，動(dòng)物神經(jīng)行為功能恢復(fù)。結(jié)論胡黃連苷Ⅱ可能通過(guò)降低ERK1/2磷酸化水平，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡。

胡黃連苷Ⅱ；腦缺血；凋亡；細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2；大鼠

細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（extracellular signal-regulated kinase，ERK1/2）信號(hào)通路是絲裂原活化蛋白激酶通路的組成之一，介導(dǎo)細(xì)胞增殖、分化和凋亡等[1]。研究證實(shí)，腦缺血損傷可誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，ERK1/2通路的激活能夠促進(jìn)細(xì)胞的增殖、分化與修復(fù)，減輕神經(jīng)細(xì)胞損傷[2]。研究證明，ERK1/2通路在腦缺血損傷中能夠促進(jìn)炎癥反應(yīng)及介導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡[3]。ERK1/2通路抑制劑U0126可抑制腦缺血大鼠ERK1/2通路的激活，保護(hù)血腦屏障損傷，緩解腦水腫[4]。本課題組研究證明，胡黃連苷Ⅱ在腦缺血損傷的多個(gè)環(huán)節(jié)中發(fā)揮作用，具有抗氧化、抗炎、減輕腦水腫、抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡、促進(jìn)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)等神經(jīng)保護(hù)作用[5-7]。本實(shí)驗(yàn)擬明確ERK1/2在腦缺血損傷后細(xì)胞凋亡中的作用，以及胡黃連Ⅱ?qū)RK1/2表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物模型

成年健康雄性Wistar大鼠90只，體重220～250 g，無(wú)特定病原體級(jí)，青島市藥品檢驗(yàn)所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[SCXK（魯）20100010]。隨機(jī)選擇15只為對(duì)照組，其余75只應(yīng)用線栓法[8]經(jīng)左側(cè)頸外-頸內(nèi)動(dòng)脈插線建立大腦中動(dòng)脈阻塞模型。動(dòng)物術(shù)前禁食12 h，腹腔注射10%水合氯醛3 ml/kg麻醉動(dòng)物，仰臥位固定、無(wú)菌操作。將術(shù)后2 h死亡的15只大鼠剔除，改良神經(jīng)功能缺損評(píng)分（modified neurological severity score，mNSS）7～12分為模型成功的標(biāo)志[9]。將成功的60只動(dòng)物模型隨機(jī)分為模型組、治療組、脂多糖組及U0126組，每組15只。對(duì)照組動(dòng)物除不插線進(jìn)入顱內(nèi)外，其余操作同實(shí)驗(yàn)組。

1.2干預(yù)措施

1.2.1胡黃連苷組將胡黃連苷Ⅱ（天津奎青有限公司）用生理鹽水配制成1%溶液，在缺血后2 h腹腔注射20 mg/kg。

1.2.2脂多糖將炎癥誘導(dǎo)劑脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）（北京索萊寶科技有限公司）用生理鹽水溶液配制成1%溶液，在缺血后2 h腹腔注射LPS 20 mg/kg和胡黃連苷Ⅱ20 mg/kg[10-12]。

1.2.3U0126組將ERK1/2通路抑制劑U0126-EtOH（美國(guó)Selleck公司）用10%二甲基亞砜配制成1%溶液，在缺血后2h腹腔注射U0126-EtOH 20mg/kg和胡黃連苷Ⅱ20 mg/kg[10-12]。

1.2.4模型組和對(duì)照組同步腹腔注射等體積的生理鹽水。

1.3評(píng)價(jià)指標(biāo)

1.3.1行為測(cè)試各組治療前（造模后2 h）和治療后（給藥后24 h）應(yīng)用mNSS評(píng)分評(píng)定動(dòng)物神經(jīng)行為功能，最高18分，評(píng)分越高說(shuō)明動(dòng)物神經(jīng)行為功能損傷越重，反之則較輕微。

1.3.2原位末端標(biāo)記法（terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling，TUNEL）染色治療后每組隨機(jī)選取5只動(dòng)物，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，經(jīng)心臟灌注生理鹽水200 ml，完整取腦，切取缺血部位腦組織100 mg提取總蛋白。其余腦組織置4%多聚甲醛后固定2 h，蒸餾水浸泡4 h。常規(guī)脫水、透明、包埋，連續(xù)冠狀切片5μm，貼片。石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，按TUNEL凋亡檢測(cè)試劑盒（KGA7025-50assays，北京凱基生物公司）說(shuō)明書進(jìn)行操作，3、3'-二氨基聯(lián)苯胺（3，3'-diaminobenzidine，DAB）顯色，蘇木素復(fù)染。光鏡下胞核有棕色顆粒者為凋亡細(xì)胞。陰性對(duì)照樣本不加末端脫氧核苷轉(zhuǎn)移酶，不出現(xiàn)陽(yáng)性著色。400倍顯微鏡下，每張切片隨機(jī)觀察皮質(zhì)區(qū)4個(gè)不重疊視野，細(xì)胞計(jì)數(shù)，取其均值。以凋亡細(xì)胞指數(shù)（凋亡細(xì)胞指數(shù)=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)）表示損傷程度。

1.3.3Western blot檢測(cè)取缺血部位腦組織100mg，加細(xì)胞裂解液（上海碧云天生物技術(shù)研究所）1 ml，4℃冰浴中研磨，置于4℃搖床30～60 min充分裂解，4℃、12 000 r/min離心15 min，去沉淀組織留上清液，二辛可寧酸（bicin chonininc acid，BCA）法測(cè)定蛋白濃度。取蛋白樣品20μg，應(yīng)用烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，半干法轉(zhuǎn)膜，含吐溫-20℃的三羥甲基氨基甲烷氯化鈉緩沖液（tris-buffered saline containing tween-20，TBST）室溫封閉1 h，兔抗鼠磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（phosphorylationextracellularsignal-regulatedkinase，pERK 1/2）單克隆抗體（1∶2 000）一抗4℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜10 min×3次，用HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗（1∶10 000）（美國(guó)Abcam公司）室溫孵育1 h，TBST洗膜10 min×3次。Vilber Fusion FX7化學(xué)發(fā)光多色熒光成像系統(tǒng)（法國(guó)Vilber公司）曝光顯影，Quantity one軟件分析各條帶灰度值。計(jì)算目的蛋白相對(duì)值，目的蛋白相對(duì)值=pERK1/2灰度值/ERK1/2灰度值。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，多組間比較用析因分析及最小顯著差數(shù)法，以P＜0.05為差

異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1神經(jīng)行為功能

對(duì)照組動(dòng)物活動(dòng)正常，造模動(dòng)物表現(xiàn)不同程度的神經(jīng)行為功能障礙。治療組和U0126組的mNSS評(píng)分較治療前顯著下降（t=5.668和4.081，P＜0.05）。模型組和LPS組治療前后的mNSS評(píng)分比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.819和0.276，P＞0.05）。治療后，治療組mNSS評(píng)分較模型組和LPS組顯著下降（t=5.143和6.276，P＜0.01）；U0126組mNSS評(píng)分較模型組和LPS組亦顯著下降（t=2.368和2.812，P＜0.05）。模型組與LPS組，治療組與U0126組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.004和1.143，P＞0.05）。

2.2細(xì)胞凋亡

TUNEL染色顯示，各組大鼠神經(jīng)細(xì)胞有不同程度的凋亡，胡黃連苷組和U0126組表達(dá)顯著低于模型組（t=3.124和5.231，P＞0.05）。對(duì)照組大鼠皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)量較少；模型組大鼠皮質(zhì)區(qū)凋亡細(xì)胞明顯增多。胡黃連苷組大鼠皮質(zhì)區(qū)出現(xiàn)少量凋亡細(xì)胞，各時(shí)間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.043、 0.932和1.817，P＞0.05）。LPS組大鼠凋亡細(xì)胞比治療前略有下降（t=2.967，P＜0.01），但凋亡細(xì)胞仍然較多。U0126組大鼠皮質(zhì)區(qū)出現(xiàn)少量凋亡細(xì)胞，其程度最接近對(duì)照組，兩者比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t= 0.936，P＞0.05）。見圖1。

圖1 大鼠皮質(zhì)區(qū)細(xì)胞凋亡（TUNEL×400）

2.3Western blot檢測(cè)

胡黃連苷組和U0126組神經(jīng)細(xì)胞pERK1/2蛋白表達(dá)顯著低于模型組（P=3.025和2.436，P＜0.05）。對(duì)照組pERK1/2蛋白表達(dá)較治療前略高（t=2.012，P＞0.05）。治療后，模型組pERK1/2蛋白表達(dá)顯著高于其他各組（t=3.162、5.103、4.925和6.124，P＜0.01）。胡黃連苷組pERK1/2較治療前略有提高（t=1.893，P＞0.05），但與模型組比較顯著降低（t=4.171，P＜0.01）。治療后，LPS組pERK1/2表達(dá)仍高于胡黃連苷組和U0126組（t=5.362和4.324，P＜0.01）；U0126組pERK1/2水平較低。模型組與LPS組各時(shí)間pERK1/2表達(dá)較高，模型組顯著高于其他組（t=3.76、3.893、4.176和6.132，P＜0.01）；LPS組pERK1/2表達(dá)也顯著高于其他組（t=4.126、3.675、4.539和7.316，P＜0.01）。見圖2。

圖2 Western blot檢測(cè)ERK1/2蛋白表達(dá)

3 討論

腦中風(fēng)后缺血區(qū)血流量急劇減少，神經(jīng)細(xì)胞受損，表現(xiàn)為壞死或者凋亡。實(shí)驗(yàn)證實(shí)ERK1/2通路可以介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13]。SREEKANTH等[14]研究表明，登革熱病毒可激活小鼠肝細(xì)胞內(nèi)的ERK1/2，并且有大量細(xì)胞凋亡壞死，使用FR180204（一種ERK1/2選擇性抑制劑）后，含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3（cysteinyl aspartate specific proteinase-3，Caspase-3）表達(dá)顯著降低，凋亡細(xì)胞減少，肝細(xì)胞損傷明顯減輕。NAMURA等[15]實(shí)驗(yàn)證實(shí)，U0126能夠降低前腦缺血或者局灶性缺血模型沙鼠的腦梗死面積，保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)，并且對(duì)缺氧環(huán)境中的原代皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞也表現(xiàn)出一定的保護(hù)作用。有報(bào)道證實(shí)，ERK1/2的激活可以直接導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的腫脹、壞死，而該過(guò)程獨(dú)立于Caspase家族的激活[16]。胡黃連味苦、性寒，有清熱、涼血、燥濕之功效。前期研究顯示，胡黃連苷Ⅱ能夠清除自由基、抗氧化[7]，下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶-9的表達(dá)，抑制Toll樣受體4-核轉(zhuǎn)錄因子κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，緩解腦水腫、改善大腦的神經(jīng)功能[5]，同時(shí)下調(diào)Caspase-3表達(dá)，抑制腦缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[6]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，腦缺血損傷后，皮質(zhì)缺血區(qū)神經(jīng)元ERK1/2激活，可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。治療組和抑制劑組治療后，缺血區(qū)神經(jīng)元ERK1/2激活顯著減少，細(xì)胞凋亡數(shù)量減少，從而促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞的恢復(fù)。而激動(dòng)劑組使用胡黃連苷Ⅱ后，ERK1/2激活顯著減少，神經(jīng)元細(xì)胞有所恢復(fù)，但因其早期損傷較重，恢復(fù)較差。進(jìn)一步提示腦缺血損傷后，ERK1/2通路的激活能夠介導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞死亡。胡黃連苷Ⅱ可能通過(guò)降低大鼠腦缺血損傷后ERK1/2的表達(dá)，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡而保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)。

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（張蕾 編輯）

Effect of PicrosideⅡon ERK1/2 signal transduction pathway in rats with cerebral ischemic injury

Guang-zheng ZHOU,Ya-dong GUAN,Hua ZHANG,Wei LYU,De-li FU,Li ZHAI
(Institute of Integrative Medicine,Medical College,Qingdao University, Qingdao,Shandong 266021,P.R.China)

【Objective】To explore the effect of PicrosideⅡon ERK1/2 signal transduction pathway after cerebral ischemia injury in rats.【Methods】The focal cerebral ischemic model was established by inserting a monofilament thread into middle cerebral artery for occlusion in 90 Wistar rats.The rats in the treatment group were treated by intraperitoneal injection of PicrosideⅡ(20 mg/kg).The neurobehavioral function was evaluated by Modified Neurological Severity Score points test(mNSS).The apoptotic cells were counted by terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling assay.The expression of pERK1/2 was determined by Western blot.【Results】After cerebral ischemia,the rats had neurological behavioral malfunction. As time progressed after cerebral ischemia,the apoptotic cells and the expression of pERK1/2 significantly increased compared to those in the control group(P＜0.05).The apoptotic cells and the expression of pERK1/2 in the treatment and U0126 groups were much lower than those in the model group(P＜0.05).In the LPS 6 h subgroup the apoptotic cells and the expression of pERK1/2 were the highest,and slightly recovered during the later period.【Conclusion】PicrosideⅡmight reduce cell apoptosis by inhibiting the activation of ERK1/ 2 in cerebral ischemic injury.

PicrosideⅡ;cerebral ischemia;apoptosis;ERK1/2;rat

R743.31；R285

A

1005-8982（2015）27-0022-05

2015-04-15

周廣正，青島大學(xué)在職碩士學(xué)位研究生，現(xiàn)工作單位為山東省菏澤市成武縣人民醫(yī)院