快速寬場顯微光切片成像技術分析及研究進展

張剛平+李毅彩+何春蘭

摘要：本文描述了目前流行的幾種基于寬場顯微鏡的快速光切片成像技術和裝置，包含非干涉測量的寬場光切片技術、基于變形光柵的實時三維成像寬場顯微切片技術、基于微條紋陣列LED的顯微光切片技術、基于變焦透鏡的寬場顯微光切片技術。通過對這幾種技術的分析，找到他們的優缺點，充分發揮技術的優勢和應用范圍，同時也對這些技術提出了更高的要求。對寬場顯微鏡的改造可更大限度的發揮它的優勢，使其能廣泛應用于生物醫學成像及相關領域。

關鍵詞：衍射光柵;變形光柵;變焦透鏡

中圖分類號：G642.0 ? ? 文獻標志碼：A ? ? 文章編號：1674-9324（2015）45-0076-02

伴隨光學顯微鏡技術的飛速發展，顯微技術也在相應的不斷進步。經過有關光學系統及信息處理能夠使顯微鏡的分辨率大幅提高，用于生物樣品三維信息的獲取、記錄、處理和顯示的顯微鏡成像系統也得到了很大發展。在顯微鏡成像過程中，其所獲取的每一幅圖像都包含了焦平面和焦平面外的光信息，焦平面外的信息對所成圖像造成了很大的模糊干擾，因而使得圖像清晰度降低甚至無法識別。為了去除這些離焦光信息，人們嘗試了許多解決辦法。激光掃描共焦技術在熒光顯微成像的基礎上克服了離焦平面信息的干擾，從而得到了清晰地聚焦平面的圖像。但是其缺點也是很顯然的：其價格昂貴不利于技術的普及;不能得到樣品完整、真彩的圖像;由于需作二維逐點掃描，其成像速度受到限制，不能對樣品實施快速動態成像。寬場顯微鏡是一套傳統的顯微鏡，其價格便宜，可廣泛用于各種行業實現對樣品的快速觀測，為了實現對樣品的三維觀察，首先需要對樣品進行光學切片，在基于寬場顯微技術的基礎上經過對顯微鏡的改進，可采用各種方法實現寬場顯微鏡的光學切片成像。隨著對微觀世界更深入的研究，人們希望進一步提高光切片質量和切片的速度等。本文將介紹幾種基于寬場顯微技術的快速三維成像技術。

一、非干測量的寬場光切片技術

細胞膜的活動在細胞的力學中扮演著重要的角色，因此觀測細胞膜的三維結構是非常重要的。一般我們使用相襯和熒光顯微鏡技術去觀察它的活動，然而這種光學觀察只能提供細胞邊界的信息，很難去了解細胞表面的拓撲結構。為了清楚實時地觀察到生物樣品的三維結構，這種儀器應該滿足分辨率高、成像速度快、視野大等多種要求。在基于寬場顯微光切片的技術基礎上，可以采用一種新的光學技術——非干涉測量的寬場顯微鏡光學輪廓測量技術來實現這一要求。這一技術不需后期的掃描機制即可得到三維圖像，系統中探針是浸入水的物鏡，它的工作距離在毫米范圍內。圖1顯示的是實驗裝置，該裝置采用傳統的光學顯微鏡作為主要的設備，使用一個功率固定的鎢鹵素燈作為光源，它的功率波動范圍為小于1%，帶通濾波片的波長范圍為350～610納米。這套系統使用柵格圖案在空間相位0，2π/3，4π/3獲得三幅圖像，然后使用零查探測原理去刪除這個柵格圖案獲得光學剖面圖像，通過對圖像的后期處理即可呈現樣品的3D結構。

二、基于Z軸自動控制寬場光切片技術

在對細胞或者微小的樣品進行觀察時，顯微鏡是必不可少的工具，但是一般的顯微鏡包括寬場顯微鏡只能觀察他們的二維圖像，為了得到三維的圖像，需要在顯微鏡的z軸方向上進行光學切片，得到不同焦平面的圖像，然后利用計算機技術實現三維重構。為了在寬場顯微鏡中得到Z軸上不同的焦平面信息，需要對軸進行微調，Z軸方向每上升或者下降一定的距離獲取一副圖像。傳統的方法是用手動的方式去調節Z軸的旋鈕，達到Z軸上升或下降的目的。這種方式使得得到的斷層掃描圖像難以獲得足夠的精度和足夠薄的切層厚度，而且各個斷層圖像的層厚變得不均勻，這樣將在很大程度上影響圖像的三維重構效果，同時在進行斷層掃面時圖像的拍攝時通過手動的方式控制拍攝，這樣拍攝一副斷層圖像需時過長，在熒光樣品拍攝前往往已經暴露在激發光的強光之下，這樣大大增加了樣品被強光漂白導致損傷的危險。因此，一種采用全自動寬場顯微光切片的技術將具有重要意義。

這種技術能通過計算機控制顯微鏡物鏡Z軸作精確的微動，來對樣品進行逐層掃描成像，其精度可達到納米級，同時它還能控制攝像系統對每層斷層圖像進行自動的攝取與存儲，不需人工干預。因此，在光路中加裝一套激發光快門開合系統，通過計算機同步控制快門開合系統和自動數碼成像（或視頻圖像）拍攝系統，這些裝置的增加對寬場顯微光切片技術有著非常重要的意義。這樣的一套系統可廣泛應用于各種醫學和生物研究領域，特別是需要觀察三維斷層的相關領域如生物醫學成像與生物醫學材料的領域，具有非常重要的實用價值。

三、變形光柵光切片技術

要想得到物體不同層的圖像，傳統的方法是移動透鏡或者相機，但是在一些應用中物體或者成像條件是快速變化的，需要設備能在相同條件下同時捕獲多個層的圖像。其中一種方法是采用分束器，將一束光分成幾束，然后使用多個相機來獲得圖像，通過移動相機來達到獲取不同焦平面圖像的目的。但是這種方法會導致復雜的光學系統并且需要多個同步相機。一種使用特別設計的變形光柵能被當作分束器使用，在單圖像平面同時記錄多個物體不同焦平面的信息，這將只需要一個簡單的光學系統便可實現同時獲取不同層面的圖像，大大降低了成本。使用變形光柵同時得到多個物層面圖像的方法原理在于，變形光柵是一個二元位相光柵。其暗區域能增加光學厚度，它在非零衍射序列具有聚焦的功能。特別設計的光柵在每一個變形序列上具有不同焦長的透鏡的作用，在圖像視野產生假的三維圖像。光柵焦長和圖像面的分離是通過設計光柵結合物體放大倍數實現的。該技術的基礎是變形的衍射光柵，它的光柵線由一個半徑為二次方程的光柵線構成。它產生的光柵線是圓弧并且它的中心是偏離透鏡軸中心的，如圖2所示，變形光柵扮演一套透鏡的功能，它能修改每一個衍射序列（+1，0，-1）的焦長，這導致三個物面在同一個探測器面上呈現。當光束進入系統時，零序列衍射產生一幅激光束焦斑圖像，+1和-1序列提供光束焦平面后和焦平面前兩個層面的圖像。因此，利用這種技術可在不需要任何掃描特別是縱向掃描，可實現對樣品多層面同時一次成像。但是缺點是一次只能進行三層成像，需要更多層數成像需要加裝Z軸掃描裝置。

四、基于變焦透鏡的寬場顯微光切片技術

這種技術原理類似于前面介紹的基于Z軸自動控制寬場光切片技術，將Z軸的機械控制裝置用可變焦的透鏡來代替。通過改造寬場顯微鏡可實現這一功能，如圖4所示。在該設備中，需要自制一模塊，該模塊包含一些透鏡和可電控的變焦透鏡放置在靠近物鏡的地方和成像端口想連接，同時為了在目鏡中能觀察到清晰的圖像許在目鏡端口加裝一相同變焦透鏡。這一裝置進行光學切片的原理相對比較簡單，通過計算機或者其他裝置控制變焦透鏡的驅動裝置，改變電流，透鏡的焦距會隨著電流大小發生變化，焦距變化后可得到樣品不同層的光學信息，完成光學切片的功能。通過實現計算機控制，可實現快速自動寬場顯微鏡光學切片技術。另外為了讓顯微鏡的改造變得更加簡單，可以在顯微鏡的成像接口處加裝一套帶有變焦透鏡的中繼成像裝置。這一技術在原理上并不復雜，結構簡單，不需要加裝機械掃描裝置，減少了使用機械裝置進行掃描時帶來的震動，同時通過精密電流控制可使得描層厚均勻，但是掃描需要時間比較長，為實現實時快速的掃描帶來了挑戰。

五、小結

上面介紹的快速寬場顯微鏡光切片技術各有優缺點，他們大多數需要對Z軸進行掃描，不僅影響了掃描速度，而且使用高精密的控制設備成本也比較高，掃描層厚也不均勻，針對這些缺點，我們可以在寬場顯微鏡的基本框架結構上，結合多種寬場光切片技術實現實時觀察樣品，另外發展一套新的快速實時寬場顯微光切片技術。例如在顯微鏡的成像接口處加裝一套變形光柵系統和變焦透鏡，可以在改變一次變焦的同時獲得三層切片圖像，可大大縮短切片的時間，降低樣品長時間暴露在強光下導致的光損傷，它能快速的進行實時光學切片。這樣的一個系統預期可廣泛應用于各種需要進行實時三維斷層觀測的領域如生物醫學，生物材料等領域，具有非常重要的實用價值。

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