濟瀆紅蒜莖尖脫毒快繁培養技術研究

陳麗，趙玉玲，張慶社，田瑞昌，陳坤，葛佳文，牛小沛，馬朝喜

（河南濟源市農業科學院，459000）

大蒜作為一種特殊蔬菜，不僅含有豐富的維生素、氨基酸、礦質元素等營養成分，而且含有特殊的抗菌、抗癌等活性物質，被認為是重要的天然保健品[1，2]。濟瀆紅蒜是濟源市地方特色品種，味道辛辣鮮美、蒜薹短粗肥嫩無梗絲、蒜泥味道長久，其獨特的品質深受濟源人喜愛。濟瀆紅蒜蒜皮紫紅透明、光澤喜人，在清朝時作為貢品，只有皇族才能享用，因此又被稱為“濟瀆金蒜”。近年來，由于病毒病的為害，我國大蒜種性普遍退化、單產降低、品質變劣，一些名優特種大蒜因受病毒病為害幾乎瀕于絕種[3，4]。本試驗以濟瀆紅蒜為材料，以期篩選出適合其脫毒快繁的培養基，建立一套適宜濟源市名優大蒜地方品種脫毒快繁的技術。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

濟瀆紅蒜，由濟源市農科院種植培育。

1.2 試驗方法

①剝離莖尖時間的篩選 2014年5月底收獲濟瀆紅蒜，從收獲初開始，每月進行1～2次莖尖剝離試驗。

②外植體處理 選擇生長良好的濟瀆紅蒜流水沖洗5 h，用洗潔精沖洗數次后，用手術刀片切除2/3留基部備用。無菌操作下75%酒精消毒35 s→無菌水沖洗1次→0.1%氯化汞滅菌10 min→無菌水沖洗8次進行材料表面滅菌。然后用無菌濾紙吸干水分，在顯微鏡下剝離莖尖，莖尖長度為0.2～0.6 mm，以備接種。

③愈傷組織誘導培養基配方的篩選 以1/2 MS培養基為基礎培養基，設6-BA、2，4-D、NAA 3個因素，每個因素3個水平，詳見表1，共9個處理，詳見表2，每處理3次重復。培養基pH值6.0、蔗糖濃度為30%、瓊脂粉含量3 g/L。將剝離好的莖尖接種在不同培養基上，散射光光照強度2 000～3 000 lx、溫度（25±2）℃、光照時間 12 h/d進行培養。

④分化增殖培養基的篩選 以1/2 MS培養基為基礎培養基，加入不同濃度的 6-BA、NAA、2，4-D，共6個處理，詳見表3，每處理4次重復；培養基pH值6.0、蔗糖濃度30%、瓊脂粉含量3 g/L。將誘導的愈傷組織接種在不同培養基上，培養條件同③。

⑤生根培養基的篩選和移栽 以1/2 MS培養基為基礎培養基，加入不同濃度6-BA、NAA，詳見表4，共4個處理；將增殖濟瀆紅蒜苗接種于生根培養基上，觀察生根情況；培養條件同③。將生根后的脫毒苗，移栽到已滅菌的草炭∶蛭石=2∶1的穴盤中。移栽后覆蓋遮陽網防曬、防蟲網防蚜蟲。

⑥大蒜內病毒的檢測 將剝離的大蒜莖尖培養2個月后，取部分愈傷或小苗搗碎、研磨，制成組織汁液，用磷酸鹽緩沖液在3 000 r/min離心20 min后，在電鏡下觀察，并以未脫毒的樣品作對照，確認含病毒的基本形態和特征。

2 結果與分析

2.1 不同時間對濟瀆紅蒜莖尖剝離的影響

根據每月剝離的情況發現，每年的5月底到翌年2月底，莖尖容易剝離，并且8～10月剝離的莖尖誘導成活率高于其他時間。因為初期剝離的莖尖，莖尖含水量大，剝離過程中易破碎；而后期，莖尖較小，不易剝離。

表1 試驗設計 mg/L

表2 濟瀆紅蒜愈傷組織誘導培養基的篩選

表3 濟瀆紅蒜分化增殖培養基的篩選

2.2 濟瀆紅蒜愈傷組織誘導培養基的篩選

為了促進莖尖成活以及分化，需選擇合適的激素配比。試驗觀察發現，如果在接種后14 d，莖尖出現透明狀，說明在誘導愈傷過程中出現玻璃化現象，且培養基濕度大；接種20 d后，莖尖泛綠色，并且膨大，說明開始誘導愈傷。正常的愈傷組織是黃綠色，且結構較為緊密，這種愈傷組織分生能力強，芽點較多；若為深綠色，則太硬不易分化，且最后容易轉變為淺黃色而死亡。由表2可知，1/2 MS+6-BA 1.5 mg/L+2，4-D 0.2 mg/L+NAA 0.8 mg/L的培養基愈傷組織誘導率較高，但愈傷組織呈淺黃色，不分化、不成塊，在培養過程中逐漸玻璃化死亡。因此，最佳的誘導培養基為1/2 MS+6-BA 1.8 mg/L+2，4-D 0.2 mg/L+NAA 0.6 mg/L。

2.3 濟瀆紅蒜分化增殖培養基的篩選

選擇較好的愈傷組織進行分化增殖培養，在激素濃度較高的條件下，誘導增殖率會降低，主要表現為形成畸形苗、葉片較長，芽尖生長較慢；有些會出現芽點較多、較綠，而分化比較少的情況。從表3可以看出，1/2 MS+6-BA 2.6 mg/L+2，4－D 0.3 mg/L+NAA 1.5 mg/L，增殖系數可達4倍，出苗比較整齊，分化苗生長比較健壯。

表4 濟瀆紅蒜愈傷組織的繼代培養情況

2.4 濟瀆紅蒜生根培養基的篩選

從表4可以看出，1/2 MS+6-BA 2.2 mg/L+NAA 0.3 mg/L，生根效果最好。6-BA濃度為2.2 mg/L的培養基中，生根少且較慢，出現根部膨大的現象，影響移栽成活率。

2.5 病毒檢測結果

隨機取再生大蒜幼苗50株，用未經脫毒的大蒜幼苗作對照，進行檢測。結果發現，對照100%含病毒，且病毒含量很高；而再生的大蒜幼苗有68%不含病毒，即脫去病毒；15%的病毒含量高，但仍低于對照。說明莖尖剝離脫毒可降低病毒含量。

3 討論與結論

有資料顯示，切取蒜瓣內幼芽的莖尖分生組織，經組織培養獲得脫毒苗是解決大蒜品種退化、提高大蒜產量和質量的有效途徑[5～7]。莖尖剝離過程中，其大小直接影響脫毒效果及成活率。試驗中發現，0.3～0.5 mm長的莖尖有利于提高成活率并且脫毒效果比較明顯；雖然0.1～0.2 mm的莖尖脫毒效果最好，但是接種后成活率不高；而莖尖長度低于0.4 mm時，誘導愈傷時玻璃化現象嚴重，原因有待進一步分析。但在脫毒過程中，完全脫毒的成功率還不是很高，下一步需要改進脫毒方法。

[1]管正學，王建立，張學予.我國大蒜資源及其開發利用研究[J].自然資源，1994（5）：54-59.

[2]廉潔燮，金今松，馬英金，等.大蒜的應用價值及其產品[J].延邊農學院學報，1990（4）：74-80.

[3]張寒霜.大蒜莖尖脫毒培養及快繁技術研究[J].華北農學報，2006，21（B11）：117-119.

[4]欒非時.脫毒大蒜花原始體培養增殖技術的研究[J].中國蔬菜，1995（3）：4-6.

[5]高山林，金雍安，蔡朝暉.大蒜分生組織培養脫病毒和快速繁殖技術[J].植物資源與環境學報，2000，9（3）：15-18.

[6]鄭曉峰，黃剛.麻江紅蒜莖尖組織培養及快繁技術研究[J].長江蔬菜，2008（24）：16-17.

[7]劉德軍.大蒜——藥用動植物種養加工[M].北京：中國中醫藥出版社，2001：55-56.