不同西瓜品種枯萎病抗性鑒定方法比較

張屹，劉建雄，梁志懷，李基光，張云

（湖南省西瓜甜瓜研究所，長沙，410125）

西瓜枯萎病是由西瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporumf．sp．niveum，FON）侵染所致的土傳維管束病害，是嚴重制約西瓜生產的病害之一[1～3]。已有文獻報道，尖孢鐮刀菌西瓜專化型生理小種有4個，0、1、2和3，其中，1號生理小種在我國致病力最強、存在范圍最廣[4]。因此，以1號生理小種為病原菌株，開展西瓜品種枯萎病抗性評價具有很強的代表性。隨著分子生物學的發展，研究者們已對西瓜枯萎病病菌1號生理小種的抗病基因（Fon-1）進行定位[5～8]，并利用已開發的分子標記開展不同西瓜新品種Fon-1基因的分布調查，為西瓜新品種抗性鑒定提供了重要的依據。本文通過對20份不同類型西瓜品種進行抗枯萎病室內人工接種鑒定與分子檢測分析，以期為西瓜抗病分子育種和抗源篩選提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試西瓜為湖南省西瓜甜瓜研究所引進的雜交品種20個，其中包括有籽西瓜、無籽西瓜和小果型西瓜3類。

供試病原菌為西瓜枯萎病菌1號生理小種（FON-1），由北京農林科學院蔬菜研究中心西瓜課題組許勇老師惠贈。

1.2 試驗方法

①接種鑒定方法 參照耿麗華等[9]報道的西瓜苗期接種鑒定方法，于2014年5～7月在湖南省西瓜甜瓜研究所基地大棚內進行。供試西瓜材料按編號播種于滅菌的沙子中，當西瓜幼苗長至2葉1心時，置于孢子濃度為5×106個/mL的西瓜枯萎病病菌懸浮液中接種15 min。每個品種設置3個重復，分別調查病株率。

②DNA提取 待接種后7 d進行單株取樣，采取CTAB法提取基因組DNA[10]。

③PCR反應體系 均采用12 μL，包括 1.2 μL 10×Buffer（含 Mg2+），1 μL 2.5 mmol/L dNTPs，1 μL 10 μmol/μL 引物，0.2 μL 5 U/μL Taq DNA 聚合酶，2 μL 30 ng/μL 模板 DNA，用去離子水補足至 12 μL。引物7716_fon為張屹等[8]已發表的西瓜抗枯萎病基因分子標記，由上海生工生物技術公司合成。

7716_fon引物序列為：5'-TTAAAAATCATCTCCTCTTTAAAACTATT-3'，5'-ATATATTTGGTCTCCGAGTGTTCAA-3'。

2 結果與分析

2.1 枯萎病抗性分析

用中國西瓜主產區當前分布最廣的尖孢鐮刀菌西瓜專化型1號生理小種（FON-1）對供試的20個西瓜品種進行苗期枯萎病接種鑒定，結果表明（表1），20個品種對枯萎病表現出不同抗性。其中，9個品種表現為高抗（HR，枯萎病病株率0～20%），占總數的45%；2個品種表現為中抗（MR，枯萎病病株率21%～50%），占總數的10%；5個品種表現為輕抗 （LR，枯萎病株率51%～80%），占總數的25%；而表現為感病（S，枯萎病病株率80%以上）的品種有4個，占總數的20%。

表1 20個西瓜品種的接種鑒定結果與分子檢測結果比較

2.2 抗病基因分子檢測

利用CAPS標記7716_fon對20個西瓜品種Fon-1基因進行分子檢測。結果表明（圖1），有12個品種能擴增出170 bp的特異帶，基因型鑒定表現為抗枯萎病品種；8個品種僅能擴增出104 bp的特異帶，基因型鑒定表現為感枯萎病品種。

2.3 田間枯萎病接種鑒定與分子鑒定結果比對

利用國內西瓜枯萎病病菌優勢小種對引進的20個西瓜品種進行抗性鑒定及分子檢測結果對比，結果顯示（表1、圖1），CAPS 標記 7716_fon 可以有效區分抗、感枯萎病材料，其結果與抗性鑒定結果吻合，并將病株率70%定性為感抗界限。

3 討論與結論

西瓜抗枯萎病育種工作早在1902年即開展，第一個抗病品種Conqueror是通過對枸櫞西瓜的抗性轉育育成，此后，Calhoun Gray、Jubilee、Crimson Sweet、Summit、Smokylee 等抗病性強的品種相繼問世[11]。近年來，隨著設施農業的迅速推廣，連作障礙成為西瓜生產的主要制約因子。因此，西瓜育種家把抗枯萎病作為了最重要的選育性狀之一。本研究中所引進的品種包括了5個無籽西瓜、11個有籽西瓜和4個小果型西瓜品種。通過枯萎病苗期接種鑒定發現，4個小果型西瓜品種均感枯萎病；無籽西瓜中1個表現為高抗、1個表現為中抗、3個表現為輕抗；而有籽西瓜中8個表現為高抗、1個表現為中抗、2個表現為輕抗。不同類型的西瓜品種抗性差異明顯，推測原因是，現今小果型西瓜品質與枯萎病性狀并存的抗性親本材料依然偏少，未能在育種中得到很好的運用。因此，利用分子標記輔助選擇技術對優良性狀基因進行聚合，選育優良性狀材料是重要的趨勢。

圖1 CAPS標記（7716_fon）在參試西瓜品種中的擴增結果

張國良等[12]研究指出，西瓜枯萎病抗性遺傳可能受多基因控制，不同資源材料其抗病基因可能各不相同。隨著西瓜全基因組信息的公布[13]，西瓜在進化過程中也丟失了部分抗病基因。本研究利用與西瓜枯萎病抗性基因（Fon-1）緊密連鎖的CAPS標記7716_fon進行驗證發現，該標記的檢測結果與苗期接種鑒定結果吻合，而且以病株率70%為界限對抗、感枯萎病進行了有效區分。但是，7716_fon能檢測含有Fon-1基因的品種對病原菌表現的抗病性程度差異，我們初步認為是由于西瓜的抗源不同，導致與其相關聯的生長勢、生物量存在差異，進而影響其抗性反應表現。本研究首次利用分子標記對西瓜枯萎病發病率進行了定性分析，并將病株率70%定義為感抗界限，可以加快西瓜抗性育種的進程，為快速進行栽培品種的抗性分子改良提供了一條有效的技術途徑。

[1]徐潤芳，楊鼎新.我國西瓜抗枯萎病育種的進展與前景[J].中國西瓜甜瓜，1992（1）：2-5.

[2]周鳳珍，康國斌.西瓜部分抗枯萎病材料的抗性遺傳研究[J].中國西瓜甜瓜，1996（2）：17-18.

[3]Zhang Z G,Zhang J Y,Wang Y C,et al.Molecular detection ofFusariumoxysporumf.sp.niveumandMycosphaerella melonisin infected plant tissues and soil[J].FEMS Microbiol Lett,2005,249(1):39-47.

[4]張興平，王鳴.我國西瓜枯萎病生理小種分化研究初報[J].中國西瓜甜瓜，1991（1）：39-43.

[5]Xu Y,Ou Y X,Zhang H Y,et al.Identification of a RAPD marker linked toFusariumwilt resistant gene in wild watermelon germplasm (Citrullus lanatusvar.citroides)[J].Acta Botanica Sinica,1999,41(9):952-955．

[6]許勇，張海英，康國斌，等.西瓜抗枯萎病育種分子標記輔助選擇的研究[J].遺傳學報，2000，27（2）：151-157.

[7]Leigh K,Fenny D.Draft of RAPD map of watermelon[J].American Society for Horticultural Science,2001,126(3)：344-350.

[8]張屹，張海英，郭紹貴，等.西瓜枯萎病菌生理小種1抗性基因連鎖標記開發[J].中國農業科學，2013，46（10）：2 085-2 093.

[9]耿麗華，郭紹貴，呂桂云，等.西瓜枯萎病菌生理小種鑒定技術體系的建立和驗證[J].中國蔬菜，2010（20）：52-56.

[10]Murray M G,Thompson W F.Rapid isolation of high molecular weight plant DNA[J].Nucleic Acids Research,1980,8(19):4 321-4 325.

[11]張屹，魏林，許勇，等.西瓜枯萎病的研究進展[J].湖南農業科學，2013（5）：67-70.

[12]張國良，王春生，楊坤，等.西瓜枯萎病抗性材料的轉育及其遺傳規律的研究[J].安徽農業科學，1999，27（6）：616-618.

[13]Guo S G,Zhang J G,Sun H H,et al.The draft genome of watermelon (Citrullus lanatus)and resequencing of 20 diverse accessions[J].Nature Genetics,2012,45:51-58.