刺芹總黃酮的微波輔助提取及抑菌性研究

李 麗，李曉嬌，黃金金，楊曉芳

（保山學(xué)院資源與環(huán)境學(xué)院，云南保山 678000）

刺芹總黃酮的微波輔助提取及抑菌性研究

李 麗，李曉嬌，黃金金，楊曉芳

（保山學(xué)院資源與環(huán)境學(xué)院，云南保山 678000）

以云南刺芹為原料，微波輔助提取其中的總黃酮，并對(duì)刺芹總黃酮粗提濃縮物對(duì)枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌3種細(xì)菌進(jìn)行抑菌性測試。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化了刺芹總黃酮的提取工藝。最佳工藝條件為料液比1∶25 g／mL，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，微波功率210W，提取時(shí)間60 s，總黃酮平均得率為5.07%。刺芹總黃酮粗提液對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的抑菌效果較強(qiáng)，對(duì)大腸桿菌無抑制效果。

刺芹；總黃酮；抑菌；微波

刺芹（Eryngium foetidum）為傘形科刺芹屬植物，又名刺芫荽、洋芫荽、緬芫荽、阿瓦芫荽等，廣泛分布于廣東、廣西、貴州、云南等地區(qū)，具有特殊的香味，廣受人們喜愛，在膳食中常被用作調(diào)料，味同芫荽，還具有疏風(fēng)散寒，引氣消滯之功效，可以治療風(fēng)寒感冒，胃寒呃逆，跌打腫疼，急性傳染等疾病等，是兼具食用和藥用價(jià)值的植物。近年來，對(duì)其相關(guān)研究也逐見報(bào)道，其中，其抗菌［1-2］、抗氧化性能［3］、及揮發(fā)成分的研究相對(duì)較多［4-7］，成分的測定［8］也見報(bào)道，而對(duì)其黃酮的提取研究目前報(bào)道還較少。

廣泛存在于綠色植物體中的黃酮類化合物，眾多研究表明具有良好的抗病和保健功能［9-10］，目前，在醫(yī)藥、食品、化妝品及保健品行業(yè)作為抗氧化劑得到了大量應(yīng)用。本文使用微波輔助法，提取刺芹總黃酮類化合物，并對(duì)枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌3種常見細(xì)菌進(jìn)行抑菌性能測試，旨在為刺芹的綜合利用提供一定參考。

1 實(shí)驗(yàn)過程

1.1 藥材、試劑及儀器

刺芹，采自云南保山，清洗，干燥，用旋風(fēng)式粉碎磨粉碎，過0.180 mm（80目）篩，備用；蘆丁（優(yōu)級(jí)純），亞硝酸鈉、氯化鋁、氫氧化鈉、乙醇均為分析純；蒸餾水。

旋風(fēng)式粉碎磨（杭州麥哲儀器有限公司）；MW20-M605微波爐（廣東歐派集團(tuán)有限公司）；電子天平（奧豪斯儀器上海有限公司）；722型光柵分光光度計(jì)（上海第三分析儀器廠制造）；2XZ -1型旋轉(zhuǎn)式真空泵（南京真空泵廠）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；恒溫振蕩培養(yǎng)箱（HZQ-XI00A）；顯微鏡（Smart）；移液槍（芬蘭百得）；不銹鋼立式滅菌器（LDZX-75KB）；電熱恒溫干燥培養(yǎng)箱（DHP-9082）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取充分干燥至恒重的蘆丁0.0286 g，置于50mL容量瓶中，用50%乙醇溶解并定容到刻度，得到質(zhì)量濃度為0.0572 g／L的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別取上述蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5mL于6支25mL比色管中，分別加入加50%乙醇至12 mL，加入0.7 mL 5%NaNO2溶液，搖勻；放置5min后，加入0.7mL 10%AlCl3溶液搖勻，放置6 min后，再加入5 mL 4%NaOH溶液，搖勻；用50%乙醇稀釋至刻度，10 min后，同時(shí)以試劑空白為參比，在波長為510 nm處測其吸光度［11］。以吸光度A為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度ρ

為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1，得回歸方程：A＝8.1882ρ＋0.0870，相關(guān)系數(shù)R＝0.9978。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard cu rve of ru tin

1.2.2 總黃酮提取及含量測定

準(zhǔn)確稱取刺芹原料1.0000 g，放入250mL錐形瓶中，加入25 mL體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液，放入微波爐中在210W的條件下進(jìn)行間歇式加熱，每10 s間歇提取一次，共提取60 s。抽濾，并用適量70%乙醇溶液洗滌濾渣，取濾液，最后用70%的乙醇溶液定容至50 m L容量瓶中，得刺芹總黃酮的粗提樣品液，避光保存。

準(zhǔn)確吸取2.00 mL粗提刺芹樣品溶液于25mL容量瓶中，再按1.2.1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制方法測定其吸光度，對(duì)照所作回歸方程得到總黃酮濃度，并計(jì)算出刺芹總黃酮含量。

總黃酮得率／%＝提取液中黃酮含量／樣品質(zhì)量×100%

將總黃酮粗提液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在60℃下進(jìn)行蒸發(fā)濃縮一定時(shí)間后，取其濃縮液，用以上方法測定濃度，并避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 刺芹總黃酮提取工藝條件實(shí)驗(yàn)

考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、微波功率、提取時(shí)間4個(gè)因素對(duì)提取刺芹總黃酮得率的影響，再用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化最佳工藝條件。

1.2.4 抑菌性試驗(yàn)

取刺芹總黃酮粗提濃縮液采用濾紙片法進(jìn)行抑菌試驗(yàn)［12］：制備無菌養(yǎng)瓊脂平板，在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中分別接種上大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌，于37℃下培養(yǎng)12 h后，取0.2 mL已培養(yǎng)好的1×108cfu／mL細(xì)菌菌懸液，均勻地涂抹在所制備的營養(yǎng)瓊脂平板上，操作在無菌條件下進(jìn)行。將無菌圓形濾紙片（直徑8 mm）用刺芹黃酮提取液浸濕，晾放一定時(shí)間后將其分別交叉放置在同一含菌的平板上。平板在37℃下恒溫培養(yǎng)24 h后，測量抑菌圈直徑。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，取平均值為實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果與討論

2.1 料液比對(duì)總黃酮得率的影響

乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%，微波功率350W，提取時(shí)間60 s，料液比分別為1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40 g／mL，考察料液比對(duì)總黃酮得率的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。

圖2 料液比對(duì)總黃酮得率的影響Fig.2 E ffect of solid-liquid ratio on the total yield of flavonoids

由圖2見，當(dāng)料液比在1∶15～1∶25 g／mL之間時(shí)，隨著料液比的增加總黃酮得率隨之增加，當(dāng)料液比為1∶25 g／mL時(shí)，總黃酮得率達(dá)最大值，料液比大于1∶25 g／mL時(shí)，隨料液比增加，總黃酮得率隨之下降。因此，選擇最佳料液比為1∶25 g／mL。

2.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮得率的影響

料液比為1∶25 g／mL，微波功率350W，提取時(shí)間60 s，乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為40%、50%、60%、70%、80%，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮得率的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3。

由圖3見，總黃酮得率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)增加先增大后減小，當(dāng)體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)，達(dá)到最大值，原因可能是乙醇體積分?jǐn)?shù)較低時(shí)，其極性與總黃酮化合物的極性相差較大，不利總黃酮類化合物溶解，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)較大時(shí)，醇溶性物質(zhì)大量溶出，使得總黃酮的溶解量降低。因此，選擇最佳

乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮得率的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on the total yield of flavonoids

2.3 微波功率對(duì)總黃酮得率的影響

乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%，料液比為1∶25 g／mL，提取時(shí)間60 s，微波功率分別為70、210、350、490、700W，考察微波功率對(duì)總黃酮得率的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4。

圖4 微波功率對(duì)總黃酮得率的影響Fig.4 Effect ofm icrowave power on the total yield of flavonoids

由圖4見，總黃酮得率隨著微波功率的增大而增大，當(dāng)微波功率達(dá)到350W后，得率先降低，后趨于穩(wěn)定。其原因可能是隨著微波功率的增大，系統(tǒng)的溫度隨之升高，有利于黃酮的充分溶解，當(dāng)功率過高時(shí)，對(duì)黃酮類物質(zhì)會(huì)產(chǎn)生一定程度的破壞，同時(shí)也會(huì)使雜質(zhì)溶出不利于總黃酮的提取。因此，選擇最佳微波功率為350W。

2.4 提取時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響

采用乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%，料液比為1∶25 g／mL，微波功率350W，提取時(shí)間分別為30、40、50、60、70 s，考察提取時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5。

由圖5見，隨著提取時(shí)間的增加，總黃酮的得率隨之增大，達(dá)到50 s時(shí)得率最大，隨后出現(xiàn)下降的趨勢，這可能是由于黃酮量達(dá)最大之后，繼續(xù)微波輻射加熱使黃酮類物質(zhì)受破壞或產(chǎn)生其他物質(zhì)。因此，確定最佳微波加熱時(shí)間為50 s。

圖5 提取時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響Fig.5 Effect of Effect of extraction time on total yield of flavonoids

2.5 正交實(shí)驗(yàn)

結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、微波功率、提取時(shí)間4個(gè)單因素的較佳水平，按L9（34）設(shè)計(jì)進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。設(shè)計(jì)方案如表1所示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素和水平Table 1 Orthogonal factors and levels

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Or thogonal experim ent

由表2表可知，對(duì)刺芹總黃酮得率的影響大小順序依次為：微波功率（C）＞乙醇體積分?jǐn)?shù)（B）＞料液比（A）＞提取時(shí)間（D）。微波輔助提取的優(yōu)化工藝條件是A2B3C1D3：即乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，料液比1∶25 g／mL，提取時(shí)間60 s，微波功率210W。按此最佳工藝條件進(jìn)重復(fù)3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，總黃酮得率平均值5.03%。

2.6 抑菌性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。由表3可以看出，刺芹總黃酮粗提液對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的抑制效果較強(qiáng)，對(duì)大腸桿菌無抑制效果。

表3 刺芹總黃酮抑菌效果Table3 Inhibitory eryngium effect of total flavonoids

3 結(jié)論

1）刺芹中總黃酮的最佳提取工藝為料液比1 ∶25 g／mL，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，微波功率210W，提取時(shí)間60 s時(shí)。在此工藝條件下，總黃酮的得率為5.03%。

2）刺芹總黃酮對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的抑制效果較強(qiáng)，對(duì)大腸桿菌無抑制效果，其具有成為綠色天然抗菌劑的潛能。

［1］ 官玲亮，龐玉新，張影波，等.中國特色民族藥刺芫荽研究進(jìn)展［J］.熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，3（3）：23 -26.

［2］ 葉碧波，陳再智，陳小娟，等.剎蕪姜擾菌作用的實(shí)臉研究［J］.中國中醫(yī)藥科技，2000，7（4）：224-224.

［3］ Shrawan Singh，Singh，D R，Shajeeda Banu，et al.Determination of Bioactives and Antioxidant Activity in Eryngium foetidum L：A Traditional Culinary and Medicinal Herb［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences，2013，83，（3）：453-460.

［4］ 官智，崔宏偉，何延紅.刺芫荽揮發(fā)油的化學(xué)成分分析［J］.云南熱作科技，1996，19（4）：16-17

［5］ 高燕，馬銀海.刺芫荽揮發(fā)性成分研究［J］.昆明學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，35（3）：69-70.

［6］ 陸占國，郭紅轉(zhuǎn)，孫勝敏.索式法提取芫荽莖葉精油的化學(xué)組成及其抗菌活性［J］.化學(xué)研究，2013，35 （3）：69-70.

［7］ 翟銳銳，艾朝輝，陳麗珍.等.海南野芫荽揮發(fā)油成分分析［J］.吉林中醫(yī)藥，2014，34（5）：517-519.

［8］ Bhavana GP，Chandrika R，KJ Thara Saraswathi.Quantitative determination of secondary compounds in populations of Eryngium foetidum L.from India［J］.Bhavana etal，2013，9：24-28.

［9］ 項(xiàng)昭保，何從林，任紹光，等.野生橄欖黃酮抑菌效

應(yīng)及其在牛奶保鮮中的應(yīng)用研究［J］.食品工業(yè)科技，2004，25（10）：67-70.

［10］ 趙雅欣，高文遠(yuǎn)，張連學(xué)，等.甘草在化妝品中的應(yīng)用［J］.香料香精化妝品，2010，4：45-48.

［11］ 李麗，李羚，丘賢，等.微波輔助黃精總黃酮提取工藝研究［J］.保山學(xué)院報(bào)，2014，33（10）：39-42.

［12］ 張生潭，王兆玉，蘭新宇，等.響應(yīng)面法優(yōu)化麻瘋樹葉總黃酮提取工藝及其抗菌活性研究［J］.中草藥，2013，3（10）：308-311.

Study on M icrowave-assist Extraction and Anti-m icrobial Activities of Total Flavones from the Eryngium foetidum

LI Li，LIXiao-jiao，HUANG Jin-Jing，YANG Xiao-fang

（Department of Resource and Environment，Bao shan College，Bao shan 678000，China）

Microwave-assist technology was used to extract total flavonoids from Eryngium foetidum.The influence on this assay strategy was carefully optim ized by single factor test and orthogonal design test of L9（34）.Meanwhile，thebacteriostatic testof resulting extractwas further emulated toescherichia coli，bacillus and saphyloccocus aureus.The results indicated thatwhen solid-1iquid ratio was 1：25g／mL，the ethanol was 70% （wt%），m icrowave power was 350W，and extracting time was 60s，the optimal amount of total flavonoidswas5.07%.In addition，the extract has obvious antibacterial effect on saphyloccocus aureus and bacillus，buthas no obvious effect on.escherichia coli.

microwave-assist；Eryngium foetidum；total flavonoids；anti-m icrobial

R284

A

1004-275X（2015）03-0009-05

12.3969／j.issn.1004-275X.2015.03.003

收稿：2015-04-20

保山學(xué)院科研教研基金重點(diǎn)項(xiàng)目（13BZ012）。

李麗（1982-），女，云南昌寧人，碩士，講師，主要研究方向?yàn)榇呋瘜W(xué)。