IGF-1及其受體對(duì)小鼠皮膚作用的研究

文│王恭遠(yuǎn) 劉寧 程笳琪 赫曉燕（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院）

尚淑芬 武鋒平（山西省忻州市畜牧獸醫(yī)局）

IGF-1及其受體對(duì)小鼠皮膚作用的研究

文│王恭遠(yuǎn) 劉寧 程笳琪 赫曉燕（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院）

尚淑芬 武鋒平（山西省忻州市畜牧獸醫(yī)局）

動(dòng)物被毛的生長(zhǎng)是一個(gè)極其復(fù)雜的生理過(guò)程，受遺傳、環(huán)境、營(yíng)養(yǎng)和代謝水平等諸多因素的影響，遺傳是被毛生長(zhǎng)發(fā)育的決定性因素。小鼠是最常用的試驗(yàn)動(dòng)物之一，具有多色性、雜食性、適應(yīng)性差、繁殖力強(qiáng)等特點(diǎn)。

IGF-1也被稱作“促生長(zhǎng)因子”（somatomedin C），是一種在分子結(jié)構(gòu)上與胰島素類似的多肽蛋白物質(zhì)。1976年Rinderknecht等將人血漿中的兩種不同的類胰島素生長(zhǎng)因子分離純化出來(lái)，并于1978年成功鑒定出它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)組成和特性。由于它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)組成與胰島素原十分相似，所以又將它們命名為“IGF-1（胰島素樣生長(zhǎng)因子-1）和IGF-2（胰島素樣生長(zhǎng)因子-2）”。目前，有關(guān)毛囊周期性變化的調(diào)控機(jī)理并不十分明確，但已明確一些細(xì)胞因子參與了毛發(fā)的周期性調(diào)控，包括類胰島素生長(zhǎng)因子（IGF）。IGF-1是類胰島素生長(zhǎng)因子家族中的主要成員。研究表明，IGF-1對(duì)毛發(fā)的生長(zhǎng)發(fā)育和周期起到一定調(diào)控作用。同時(shí)還能刺激黑色素細(xì)胞、上皮細(xì)胞和毛乳頭細(xì)胞等的增殖分化。

IGF-1與其受體（IGF-1R）結(jié)合，通過(guò)其受體間的細(xì)胞信號(hào)途徑來(lái)刺激毛囊細(xì)胞增殖。IGF-1可能通過(guò)其受體的細(xì)胞信號(hào)通路刺激毛囊細(xì)胞增殖。有報(bào)道稱在山羊局部皮膚注射IGF-1能夠刺激皮膚蛋白的合成。綿羊皮膚和毛囊中均有IGF-1和IGF-1R的表達(dá)，安哥拉山羊和克什米爾絨山羊皮膚也存在大量的IGF-1R。而且IGF-1是許多類型細(xì)胞防止其凋亡的存活因子。IGF-1的抗凋亡作用可能是毛囊細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的重要因子。并且已有試驗(yàn)說(shuō)明異黃酮可以通過(guò)提高IGF-1的表達(dá)，從而促進(jìn)毛發(fā)的生長(zhǎng)和皮膚毛囊的形成。還有報(bào)道證明羊駝皮膚既是IGF-1作用的靶器官又是內(nèi)分泌器官。但有關(guān)IGF-1及其受體IGF-1R在小鼠不同發(fā)育階段的作用的研究較少。

本試驗(yàn)將以不同發(fā)育階段（3日齡、11日齡、26日齡）的小鼠作為研究對(duì)象，利用免疫組織化學(xué)方法研究IGF-1及其受體IGF-1R在不同發(fā)育階段小鼠皮膚中的分布，探討其對(duì)小鼠皮膚發(fā)育的重要作用，以期為深入研究它們?cè)诓溉閯?dòng)物的皮膚生長(zhǎng)和毛囊生長(zhǎng)發(fā)育中的生物學(xué)功能提供理論依據(jù)。

一、試驗(yàn)材料

1.試驗(yàn)動(dòng)物與取材。取3日齡、11日齡、26日齡小鼠的背部皮膚組織，由Bouin氏固定液固定。小鼠由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)羊駝生物工程試驗(yàn)室培養(yǎng)。

2.主要試驗(yàn)藥品試劑與耗材。兔抗IGF-1多克隆抗體、兔抗IGF-1R多克隆抗體、單克隆山羊抗兔二抗SABC試劑盒、DAB顯色劑等。

3.試驗(yàn)方法。

（1）石蠟切片的制備。常規(guī)方法制片，片厚5微米。

處理載玻片→試驗(yàn)組織修整→脫水、透明→浸蠟→包埋→修塊→切片、展片、烤片。

（2）免疫免疫組織化學(xué)試驗(yàn)。按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行試驗(yàn)。

切片脫蠟與復(fù)水→孵育→磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗→封閉→滴加一抗→PBS緩沖液沖洗→滴加二抗→PBS緩沖液沖洗→滴加SABC→PBS緩沖液沖洗→DAB顯色→蘇木精復(fù)染→脫水、透明→封片。

二、圖像采集與數(shù)據(jù)分析

使用顯微鏡觀察切片，拍照采集圖像。每個(gè)樣本取3張切片，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野拍照。

使用圖像分析軟件Image-Pro plus6.0，對(duì)不同日齡小鼠皮膚中IGF-1、IGF-1R蛋白的免疫組織化學(xué)結(jié)果進(jìn)行光密度值測(cè)定，得出陽(yáng)性細(xì)胞光密度值數(shù)據(jù)。使用SPSS16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析統(tǒng)計(jì)。

三、試驗(yàn)結(jié)果與分析

1.試驗(yàn)結(jié)果。IGF-1陽(yáng)性免疫反應(yīng)物在3日齡小鼠皮膚中主要分布在表皮的基底層細(xì)胞和真皮結(jié)締組織中，呈陽(yáng)性反應(yīng)，毛囊陽(yáng)性表達(dá)不明顯（圖1）；在11日齡小鼠皮膚中毛囊呈陽(yáng)性反應(yīng)（圖2）；在26日齡小鼠皮膚中的分布十分廣泛，各處均可見陽(yáng)性反應(yīng)（圖3）。

◎圖1 IGF-1在3日齡小鼠皮膚中的分布

◎圖2 IGF-1在11日齡小鼠皮膚中的分布

◎圖3 IGF-1在26日齡小鼠皮膚中的分布

IGF-1R陽(yáng)性免疫反應(yīng)物在3日齡小鼠皮膚中主要分布在表皮的基底層細(xì)胞和真皮結(jié)締組織中，同時(shí)，在毛囊外根鞘部分也有明顯分布，以上均呈陽(yáng)性反應(yīng)；在11日齡小鼠皮膚中毛囊表達(dá)明顯，呈強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)；在26日齡小鼠皮膚中的表皮、真皮中均有表達(dá)，在毛囊部分弱陽(yáng)性表達(dá)。

2.圖像分析及統(tǒng)計(jì)結(jié)果。分別將IGF-1、IGF-1R免疫反應(yīng)物在3日齡、11日齡、26日齡小鼠皮膚中的分布情況用圖像分析軟件進(jìn)行分析，得到6組試驗(yàn)數(shù)據(jù)（表1），然后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，結(jié)果見圖4。

◎圖4 陽(yáng)性表達(dá)的平均光密度

表1 陽(yáng)性表達(dá)的平均光密度

四、討論

通過(guò)以上試驗(yàn)表明，IGF-1和IGF-1R隨著日齡的增長(zhǎng)，其含量先增加后降低，在青壯年時(shí)期達(dá)到頂峰。有文獻(xiàn)報(bào)道，IGF-1對(duì)肌肉中衛(wèi)星細(xì)胞的增長(zhǎng)具有強(qiáng)有效的刺激作用。大量研究表明，IGF-1可抑制細(xì)胞凋亡，維持細(xì)胞存活。人、鼠、山羊、綿羊等的皮膚和毛囊中有豐富的GH-R、IGF-1和IGF-1R基因表達(dá)，IGF-1對(duì)毛生長(zhǎng)調(diào)控起重要作用。因此，IGF-1和IGF-1R伴隨著小鼠日齡的增大其含量在皮膚中的表達(dá)應(yīng)呈現(xiàn)變化趨勢(shì)。通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在3日齡小鼠皮膚中毛囊數(shù)量較少；在11日齡小鼠皮膚中毛囊數(shù)量很多，毛囊生長(zhǎng)致密，此時(shí)小鼠被毛發(fā)育較3日齡時(shí)相比已經(jīng)發(fā)生了很大的變化，11日齡小鼠被毛程度較高，在26日齡時(shí)被毛發(fā)育處在生長(zhǎng)靜止期，開始退化，毛囊稀少。IGF-1和IGF-1R在3日齡小鼠皮膚中表達(dá)較少，在11日齡小鼠皮膚中表達(dá)較高，在26日齡時(shí)萎縮部位弱陽(yáng)性表達(dá)。以上分析表明，在3～11日齡期間，小鼠毛囊處在生長(zhǎng)初期到生長(zhǎng)旺盛期，IGF-1、IGF-1R的含量也在不斷提高，到了26日齡時(shí)，小鼠毛囊處在生長(zhǎng)靜止期，毛囊出現(xiàn)數(shù)量減少、退化的現(xiàn)象，IGF-1、IGF-1R的含量也開始降低。這種變化與小鼠的生長(zhǎng)周期一致，即伴隨著被毛及個(gè)體的發(fā)育，IGF-1、IGF-1R的含量也在不斷提高，作用也越來(lái)越顯著，當(dāng)?shù)竭_(dá)一定時(shí)期后，被毛出現(xiàn)生長(zhǎng)靜止期，IGF-1、IGF-1R含量也開始降低，作用也越來(lái)越弱。

五、結(jié)論

IGF-1、IGF-1R對(duì)小鼠皮膚和毛囊的生長(zhǎng)發(fā)育均具有一定的作用，3～26日齡期間的小鼠的被毛中均有表達(dá)，但表達(dá)程度不同。對(duì)處在生長(zhǎng)初期的3日齡小鼠促進(jìn)作用較小，對(duì)處在生長(zhǎng)旺盛期的11日齡小鼠促進(jìn)作用明顯，表達(dá)最多。對(duì)處在生長(zhǎng)靜止期的26日齡小鼠作用不明顯。

國(guó)家自然科學(xué)基金（項(xiàng)目批準(zhǔn)號(hào)31172283）；山西農(nóng)業(yè)大學(xué)2009年引進(jìn)人才科研啟動(dòng)項(xiàng)目（XB2009020）