奶牛副結核病的血清學調查與防控措施

瞿慧方桂明顧曉李東堯劉淡寧王恒安

（1，上海交通大學農業與生物學院 200240；2，上海市奉賢區動物疫病預防控制中心 201499）

奶牛副結核病的血清學調查與防控措施

瞿慧1.2方桂明2顧曉2李東堯2劉淡寧2王恒安1*

（1，上海交通大學農業與生物學院 200240；2，上海市奉賢區動物疫病預防控制中心 201499）

副結核病是由副結核分枝桿菌引起的以牛、羊等反芻獸的慢性消化道疾病。以頑固性腹瀉、漸進性消瘦、腸黏膜增厚并形成皺襞為特征。本文采用副結核酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測方法進行了調查分析。結果表明：在430份樣品中，副結核抗體陰性414份，副結核抗體陽性16份，陽性率3.7%。本次副結核病的血清學調查的數據與分析為本病防控提供了科學依據。

奶牛；副結核病；血清學調查；防控；奉賢區

副結核病 （Paratuberculosis）是由副結核分枝桿菌引起的以牛、羊等反芻獸的慢性消化道疾病，屬于禽分枝桿菌副結核亞種，是一種細長桿菌。Johne于1895年首先發現本病，故又稱為約內氏病 （Johne病）。以頑固性腹瀉、漸進性消瘦、腸粘膜增厚并形成皺襞為特征。通常動物在出生的第一年通過采食被感染動物糞便污染的飼料感染本病，副結核的感染是一個很漫長的過程，潛伏期通常為3～5年，最早4個月的犢牛就可以表現出臨床癥狀，長的可達15年[1]。OIE將其列為B類疫病。

本病廣泛流行于世界各國，如美國、澳大利亞、日本、英國等國家，給全球范圍內的畜牧業造成了很大的經濟損失。有報道副結核病感染會造成整個牛群每頭奶牛超過200美元的損失，損失主要是產奶量的降低。副結核病對整個奶牛產業的損失估計為每年2～2.5億美元。本病沒有有效的治療方法，感染動物最后會因為此病死亡，死亡率通常在3～10%。根除本病的唯一方法就是檢出、隔離或者淘汰[2]。我國最早發現牛副結核病是在1955年內蒙古自治區的一個牧場，此后黑龍江、貴州、河北等多個地區相繼報告此病，幾乎遍及我國大部分北方區域。隨著我國國民生活水平的不斷提高，對奶制品的需求也不斷隨之增長，急需大量高產、優質奶牛，造成全國甚至世界奶牛大流通，為本病的傳播提供了便捷。上海市奉賢區是上海市政府確定的適度養殖區，目前轄區內有規模化奶 （種）牛場19家，總存欄量達11000多頭，是上海的奶牛養殖大區。結合近幾年該區奶牛結核病的防控工作，我們分析結核病檢測結果得出，在牛結核的檢疫中存在禽結核或副結核的干擾。同時，該區奶牛養殖場存在不同比例以奶牛腹瀉、消瘦為主要癥狀的病例發生。為進一步掌握該區奶牛副結核病的流行情況，我們開展了本次奶牛副結核病的調查，并對結果進行分析，旨為本區奶牛副結核病防控提供科學依據，供廣大同行參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

對奉賢區19家奶牛場進行血樣品采集，每頭牛尾根靜脈無菌采血5ml，每家牛場根據飼養規模大小采集樣品20或30份，其中育成牛10或15份，成乳牛10或15份，共采集血樣品430份。每場編號前10或15份為育成牛樣品，后10或15份為成乳牛樣品。在成乳牛樣品中，每場最后5份樣品有目的性挑選有腹瀉、消瘦、被毛長或者不發情癥狀的成乳牛，其余樣品為隨機采集。所有樣品經離心后取上清液移至離心管內，編號后放入冰箱內-20℃保存，待檢。

1.2 牛副結核抗體酶聯免疫吸附試驗 （ELISA）

1.2.1 實驗原理

用副結核抗原包被微量反應板。為了結合非特異性的抗體，樣品首先與草分枝桿菌提取物預孵育。將預孵育的樣品加入抗原包被的反應板進行孵育。檢測樣品在包被孔內孵育后，副結核特異性抗體會形成抗原抗體免疫復合物。將未結合的材料洗去，加入抗反芻動物酶標抗體，它會與抗原抗體復合物結合。洗掉未結合的酶標抗體，加入底物液。在酶的作用下，底物被氧化成藍色化合物。加入終止液后，又變成黃色。隨后的顏色深淺與檢測樣品中存在的副結核抗體成正比。診斷相關結果通過樣品的光密度值與陽性對照光密度的平均值相比較而得出。

1.2.2 判定標準

陰性：S/P%≤45%，判定為 “—”。

可疑：S/P%大于45%且小于55%，判定為 “±”。

陽性：S/P%≥55%，判定為 “+”。

1.2.3 試劑盒生產單位

北京愛德士元亨生物科技有限公司，批號：4109F。

2 結果與分析

2.1 奶牛副結核病血清學調查結果

本次調查共收集19家規模化奶牛場樣品430份，根據檢測判定標準，在430份樣品中，副結核抗體判定為陰性的有414份，副結核抗體判定為陽性的有16份，陽性率3.7%。

檢測結果顯示，在本次調查中有11家奶牛場檢測到了陽性樣品，占牛場數的57.80% （詳見表1）。

2.2 成乳牛副結核病血清學調查結果

2.2.1 有癥狀組成乳牛調查結果分析

本次采樣過程中，有針對性的從每家奶牛場中選擇5頭有腹瀉、消瘦、被毛長或者不發情等癥狀的奶牛作為檢測對象，共計95頭來檢測是否感染牛副結核病。經過實驗室檢測，在這95份樣品中，牛副結核抗體判定為陰性的有88份，牛副結核抗體判定為陽性的有7份，陽性率為7.4%。其結果表明在有腹瀉、消瘦等臨床癥狀的奶牛當中有較高一部分為牛副結核病感染，或者與其他疾病混合感染 （詳見表2）。

2.2.2 隨機組成乳牛血清學調查結果分析

本次調查除針對性的采集上述95份成乳牛樣品，其余120份樣品為隨機采集。經過實驗室檢測，牛副結核病抗體判定為陰性的有117份，副結核病抗體判定為陽性的有3份，副結核病抗體陽性率為2.5%。說明存在副結核病的隱性或慢性感染 （詳見表2）。

2.3 育成牛副結核病血清學調查結果

本次調查共采集育成牛樣品215份，經過實驗室檢測，牛副結核病抗體判定為陰性的有209份，牛副結核病抗體判定為陽性的有6份，陽性率為2.8%；其中有5個牛場存在育成牛副結核抗體陽性，占牛場數的26.3% （見表1）。

表1 牛副結核抗體檢測結果 （單位：頭、%）

3 討論

（1）王永康等[3]對上海的1250份奶牛待檢血清進行了副結核病ELISA檢測，共檢出陽性9份，陽性率0.72%。14年后，我們通過對該區奶牛副結核病的調查，ELISA檢測副結核病陽性率3.7%，說明該區奶牛副結核發病率有所上升，這與該區部分牧場反映有腹瀉、消瘦等癥狀病牛存在的臨床調查情況一致。也可能與近幾年奶牛交易大流通廣等因素有關，應引起高度重視。

表2 成乳牛抗體檢測結果 （單位：頭、%）

（2）由于病牛往往在感染后期才出現臨床癥狀，因此藥物治療常無效。盡管在體外試驗中，副結核分枝桿菌對多種抗結核類藥物敏感，但用于治療往往效果不明顯，或者僅能緩解癥狀，不能抑制其向外排菌。

（3）對于牛結核檢疫中檢出的可疑牛，常常在復檢時，給牛同時注射牛型和禽型兩種菌素作鑒別診斷，這已是當前奶牛結核檢疫中所普遍采用的方法。2013年，我們在對全區奶牛結核檢疫中檢出的670頭可疑牛，采用牛型與禽型比較變態反應試驗進行復檢，結果有10頭綜合判斷為禽結核陽性牛。由于禽結核菌與副結核菌有較多的類屬抗原，所以各國也會采用禽結核菌素來檢疫副結核病。王鐵等[4]（1993）采用副結核弱毒苗對40頭犢牛出生一周內皮下接種，7d后用禽型結核菌素進行檢疫，全部為陽性。說明該區奶牛結核病復檢鑒別診斷出的禽結核有較大比例是副結核病，應根據牛只健康情況給予隔離或者淘汰。

（4）預防本病重在加強飼養管理，特別是對犢牛更應注意給以足夠的營養，以增強其抗病力。不要從疫區引進牛只，如已引進，則必須進行檢測，確診健康時，方可混群。

（5）被病牛污染過的牛舍、走道、飼槽、用具及運動場等，要用生石灰、來蘇兒、苛性鈉、漂白粉、石炭酸等消毒液進行噴霧、浸泡或沖洗。糞便應堆積高溫發酵后作肥料用。

（6）關于本病的人工免疫，目前尚有爭論。據報道，我國有的單位從英國引進副結核弱毒株，研制出副結核弱毒疫苗，在有副結核 （無結核病）的牛場試驗，免疫期可達48個月。我國吉林省獸醫科學研究所用副結核滅活苗對污染牛群新生犢牛在7日內接種，同時采取以下綜合措施：①犢牛生后立即與母牛分開，人工飼喂牛乳。②犢牛所吃的牛奶經過消毒。③犢牛專人飼養，舍內經常清掃并消毒。④對成年牛每年定期檢疫，檢出陽性牛應隔離飼養，一旦發現開放牛立刻撲殺，并對其可能污染的場所、用具進行徹底消毒。他們用這樣方法經7年時間使某個牛場的副結核檢出率由原來的 8.83%降至0.34%[4]。

[1]Chiodini R.J,et al.The Cornell,1984,74（3）.

[2]陸承平主編.獸醫微生物學（第三版）,中國農業出版社,2001:331-339.

[3]王永康,等.上海市奶牛副結核病的血清學調查[J].上海畜牧獸醫通訊,2000（2）:24.

[4]王鐵,等.牛接種副結核病弱毒苗對禽型結核菌素變態反應的影響[J].中國獸醫科技,1993（5）:20-21.

*為通訊作者。