3D打印PLA-HA復合材料與骨髓基質細胞的相容性研究

張海峰 杜子婧 姜聞博 韓冬

·論著·

3D打印PLA-HA復合材料與骨髓基質細胞的相容性研究

張海峰 杜子婧 姜聞博 韓冬

目的 探討骨髓基質細胞與3D打印聚乳酸-羥基磷灰石 （Three-dimensional printed polylactic acid-hydroxyapatite，3D printed PLA-HA）復合支架材料的相容性，為骨組織工程選擇合適的支架材料提供理論依據。方法 將標記綠色熒光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）的骨髓基質細胞分別與3D打印PLA-HA復合材料和β-磷酸三鈣（betatricalcium phosphate，β-TCP）材料體外復合培養，采用熒光顯微鏡觀察細胞在支架材料上的生長黏附情況，并通過掃描電鏡觀察細胞在支架中的形態變化；CCK8（Cell Counting Kit8）法檢測細胞于不同時間點在材料上的黏附率以及增殖情況；堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）活性測定法檢測3 d、7 d、14 d的堿性磷酸酶活性變化。結果 骨髓基質細胞能夠在3D打印PLA-HA復合材料和β-TCP材料上黏附生長；β-TCP組細胞黏附率高于3D打印PLA-HA組（P<0.05），但3D打印PLA-HA組在12 h細胞黏附率可達到60%以上；細胞增殖實驗顯示，3D打印PLA-HA組在體外培養第4天和第7天的細胞增殖量（OD值）均高于β-TCP組與對照組（P<0.05）；3D打印PLA-HA組以及β-TCP組在第3天、第7天和第14天的ALP含量均高于對照組，且3D打印PLA-HA組第7天ALP含量較β-TCP組增多（P<0.05）。結論 3D打印PLA-HA復合材料具有良好的細胞相容性，可作為骨組織工程的支架材料。

3D打印 骨組織工程 聚乳酸 羥基磷灰石 骨髓基質細胞

由于創傷、腫瘤、感染等因素造成的骨缺損是臨床面臨的難題之一。目前骨缺損常用的修復方法有自體骨移植、異體骨移植、人工合成替代物等，但均在不同程度上存在一定問題。近年來，骨組織工程研究的不斷深入以及3D打印技術的出現，為解決個性化骨缺損的修復提供了新思路[1-3]。本研究采用體外細胞培養法對3D打印PLA-HA復合材料的生物學性能進行檢測，以探討3D打印PLA-HA復合材料用于骨組織工程的可行性，并為材料的改良提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

3D打印PLA-HA材料由上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院3D打印技術臨床轉化研發中心自建；HA購自上海積碩材料科技有限公司；PLA購自濟南岱罡生物工程有限公司；β-磷酸三鈣購自上海交通大學材料科學與工程學院。

DMEM培養基（美國Gibco公司）；胎牛血清（美國HyClone公司）；地塞米松、β-磷酸甘油鈉、L-2-磷酸抗壞血酸（美國Sigma公司）；堿性磷酸酶試劑盒、細胞增殖-毒性檢測試劑盒（南京建成生物制品有限公司）；慢病毒lentivirus-GFP載體試劑盒（上海吉瑪制藥技術有限公司）。

酶標儀（瑞士Tecan公司）；熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；顯微攝影數碼相機（美國Kodak公司）；掃描電鏡（美國Quanta公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 3D打印材料的制備

首先，利用CAD軟件設計支架材料。設計為直徑5 mm，高度2 mm的圓柱體，同時將材料屬性設置為孔徑500 μm，孔隙率60%。將設計完成的材料使用CAD軟件轉換成STL格式并輸入3D打印機。調整3D打印機相關屬性參數，打印材料。打印過程中，液態生物材料PLA-HA打印出來即迅速凝固，因此本實驗在熔融沉積造型術 （Fused deposition modeling，FDM）基礎上選擇生物擠壓方法（Bioextrusion techniques）打印生物材料PLA-HA[4]。最后，清除并修整多余的支撐材料，完成整個打印過程。

1.2.2 細胞的培養

選6～8周齡健康新西蘭大白兔，50 mL注射器針頭于一側脛骨平臺穿刺抽取骨髓液2～3 mL，加入肝素化的50 mL無菌離心管內。將骨髓與20 mL含10%（體積百分比）胎牛血清的DMEM培養基（青霉素100 U/mL、鏈霉素100 U/mL）混勻，接種于10 cm培養皿中。置于37℃、5%CO2培養箱孵育。3 d以及6 d后半量換液，9 d后完全換液，以后每3天換液1次。待原代培養細胞長滿瓶底面積90%時，進行傳代，按1∶3接種在新的細胞培養皿內。傳至第3代進行細胞計數。

1.2.3 細胞轉染及接種

將第3代細胞行細胞計數，并以5×104cells/mL的濃度制成細胞懸液，接種于24孔板內。待細胞長至60%～70%融合時，吸取細胞培養液，加入400 μL完全培養液以及終濃度為5 μg/mL的聚凝胺（Polybrene）。在含有Polybrene的培養液中加入慢病毒液，按照試劑盒要求，分別設置5個梯度（20、40、60、80和100 μL）的病毒轉染孔及1個空白對照孔，以確定轉染的最佳感染復數 （Multiplicity of infection，MOI）。24 h后，熒光倒置顯微鏡下觀察細胞的轉染效果。選取MOI最大值標記的GFP細胞消化并接種。實驗分為3組，即3D打印PLA-HA組、β-TCP組及細胞對照組。3D打印PLA-HA組、β-TCP組中每孔分別加入5 mm×5 mm×2 mm相應材料（圖1），對照組單純接種細胞，于不同時間進行觀察及檢測。

圖1 3D打印PLA-HA以及β-TCP材料Fig.1 3D printed PLA-HA and beta-tricalcium phosphate

1.2.4 光學顯微鏡及掃描電鏡觀察

每日使用熒光顯微鏡以及相差顯微鏡觀察細胞生長及與生物材料黏附情況。

分別于各時間點將生物材料取出，2%戊二醛固定，梯度乙醇脫水，乙酸異戊酯置換，臨界點干燥，表面噴金后觀察。

1.2.5 CCK8法檢測骨髓基質細胞在材料上的黏附率

將骨髓基質細胞懸液分別接種于生物材料上，細胞濃度為5×104cells/mL，于種植后4 h、8 h和12 h，按照使用說明書加入CCK8，37℃孵育2 h，選擇450 nm波長比色，測定光吸收值，并計算細胞的黏附率。

1.2.6 CCK8法檢測骨髓基質細胞與材料復合培養增殖能力

將骨髓基質細胞懸液分別種植于生物材料上，細胞濃度為5×104cells/mL，于種植后1 d、4 d和7 d，按照使用說明書加入CCK8，37℃孵育2 h，選擇450 nm波長比色，測定光吸收值。

1.2.7 堿性磷酸酶活性檢測

骨髓基質細胞成骨誘導3 d、7 d和14 d，24孔板中實驗組和對照組各取5孔，按照試劑盒相關說明書操作，使用酶標儀在520 nm波長下檢測各孔的吸光度值。

1.3 統計方法

采用SPSS 16統計軟件分析。數據以x±s表示；所測數據進行方差統計分析，組間比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 光學顯微鏡觀察

原代培養骨髓基質細胞24 h后開始貼壁，48 h后見大量細胞貼壁，細胞呈短小梭形或多角形，排列不規則；培養1周左右，細胞生長迅速并互相融成集落，呈現旋渦狀排列。

細胞與材料復合培養，熒光顯微鏡下觀察早期可見培養皿內GFP標記的細胞增多，并且向3D打印PLA-HA材料和β-TCP材料移行，并黏附于材料周邊，部分細胞直接黏附于材料表面生長。隨著復合培養時間延長，材料表面和周邊黏附的細胞逐漸增多，細胞形態多為梭形，并在3D打印PLA-HA材料多孔內部見細胞生長連成片狀，細胞生長狀態良好。兩組材料細胞生長狀態與對照組類似，未見細胞衰老以及異常分裂現象（圖2）。

圖2 熒光顯微鏡下觀察骨髓基質細胞在材料上的黏附情況（100×）Fig.2 GPF positive bone marrow stromal cells cultured with two scaffolds under fluorescence microscope(100×)

2.2 掃描電鏡觀察

掃描電鏡觀察顯示，3D打印PLA-HA材料表面較光滑，材料孔隙較大。骨髓基質細胞于3D打印PLA-HA材料上復合培養6 d，可見骨髓基質細胞緊密黏附于PLA-HA材料上，細胞向材料孔隙四周伸出偽足，分泌的細胞外基質包繞于細胞周圍，部分細胞間偽足相互接觸融合。

β-TCP表面在掃描電鏡下為顆粒狀，具有微孔結構。細胞復合培養6 d，細胞附著于材料內部微孔上生長，細胞在材料內部孔隙內伸出偽足，部分細胞表面有絲狀纖維形成（圖3）。

圖3 掃描電鏡下觀察骨髓基質細胞在材料上的生長情況Fig.3 The growth of bone marrow stromal cells cultured with two scaffolds observed by SEM

2.3 細胞黏附率測定

隨著細胞在材料上復合培養時間的延長，兩組材料上細胞的黏附率均有所增加。復合培養4 h、8 h和12 h，β-TCP組細胞黏附率高于3D打印PLAHA組（P<0.05），但3D打印PLA-HA在12 h細胞黏附率可達到60%以上（表1）。

2.4 細胞增殖測定

細胞增殖實驗顯示，3D打印PLA-HA組在體外培養第4天和第7天細胞增殖量（OD值）均高于β-TCP組以及對照組（P<0.05）（表2）。

2.5 堿性磷酸酶定量測定

ALP含量測定顯示，3D打印PLA-HA組和β-TCP組在復合培養3 d、7 d和14 d的ALP含量均高于對照組，且3D打印PLA-HA組復合培養7 d的ALP含量較β-TCP組增多（P<0.05）（表3）。

表1 細胞黏附率比較Table 1 The comparison of cell adhesion rate

表2 細胞增殖測定Table 2 The measurement of cell proliferation

表3 堿性磷酸酶定量檢測Table 3 The quantitative analysis of ALP

3 討論

隨著3D打印技術的逐步發展，3D打印材料在醫學領域的應用前景巨大[5]。目前，很多個性化生物打印材料已經應用于人體疾病的診斷與治療，并取得滿意的臨床效果[6-7]。在制備生物支架材料的過程中，通過3D打印技術的幫助，可以簡單實現材料的孔徑、孔隙率、貫通性的調控，為組織工程研究生物支架材料提供一種新的方法，同時也為臨床上選擇合適材料提供技術支持[8-9]。

PLA-HA復合材料是骨組織工程中常用的支架材料[10]。羥基磷灰石具備良好的生物相容性和骨傳導性，可提供良好的骨細胞黏附生長環境，有助于新骨的形成和生長，同時可提高材料的韌性，滿足一定的力學強度要求[11]；聚乳酸是一種具備優良生物相容性和生物降解性的聚合物，存在強度和剛度的衰減性。兩種材料復合物的多孔結構能夠為細胞生長、組織再生及血管化提供條件[12]。

本實驗所選用的PLA-HA復合材料是在常用骨組織工程材料基礎上，結合3D打印技術制備的新型支架材料。3D打印PLA-HA的孔徑為500 μm，孔隙率60%，該結構可促進組織工程中新生骨及新生血管的生成[13]。β-TCP支架材料（孔徑為400 μm，孔隙率大于70%）具備優良的生物相容性，降解性以及骨傳導性，是骨組織工程中理想的支架材料[14]。然而，3D打印PLA-HA復合材料體外生物相容性研究較少，通過與理想材料β-TCP相比，可為3D打印復合材料在骨組織工程支架研究中奠定基礎。

對生物材料相容性的研究，常用體內直接植入法和體外復合細胞培養法。由于體內直接植入材料受多種體內環境影響，不能準確反映生物材料與組織細胞的相容性，而體外復合細胞培養可以直接測定細胞與生物材料復合生長的情況，更為客觀與敏感，是研究生物材料相容性的主要方法[15]。

目前，常用的細胞活性檢測方法包括CCK-8法、MTT法、XTT法和WST-1法等。CCK-8法就是使用CCK8試劑檢測細胞活性，該試劑中含有WST-8[2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽]，它可以被細胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色產物，而生成的產物數量與活細胞的數量成正比。與MTT法相比，CCK-8法操作簡單，靈敏度高，結果準確可靠，是一種綜合指標較好的細胞活性檢測試劑[16]。通過CCK-8法檢測發現，由于材料的表面性質不同，β-TCP與骨髓基質細胞培養12 h內，其細胞黏附率較3D打印PLA-HA高。盡管如此，3D打印PLA-HA材料在12 h內細胞黏附率可達到60%以上，可以作為骨組織工程材料的選擇，該結果與Hiroshi等[17]的研究一致。同時，通過CCK-8檢測發現，與3D打印PLAHA及β-TCP材料復合培養的骨髓基質細胞其增殖不受影響，且3D打印PLA-HA對細胞的生長還有一定的促進作用。

為了更為全面檢測3D打印PLA-HA材料對骨髓基質細胞的功能狀態是否有影響，我們還進行了細胞堿性磷酸酶檢測。堿性磷酸酶蛋白是成骨細胞的標志性蛋白，在骨基質形成中起著重要作用，是體外成骨細胞分化成熟的典型特征[18]。實驗結果表明，3D打印PLA-HA材料與β-TCP相比，在第7天顯示較高水平堿性磷酸酶活性，其余時間比較無明顯差異，這與β-TCP釋放游離鈣和無機磷離子，降低其ALP活性有關[19-20]。這說明3D打印PLA-HA材料對骨髓基質細胞向成骨細胞轉化無明顯影響，同時在早期成骨誘導液的刺激下會相對促進其向成骨細胞轉化。

由此可見，3D打印PLA-HA材料與β-TCP相比，具備良好的細胞相容性，有可能作為骨髓基質細胞載體應用于骨組織工程的研究。然而3D打印材料仍存在很多問題，與理想的β-TCP相比，其細胞黏附率有待提高，需要進一步改良其孔徑和孔隙率；3D打印材料后期降解速度及生物力學性能有待研究；3D打印材料與細胞復合后植入體內環境與新生骨組織和新生血管的關系；隨著3D打印技術第三階段的到來，其能否實現與種子細胞的同步打印，促進新型組織工程技術的發展。

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本刊編輯部招聘啟事

《組織工程與重建外科》雜志由上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院主辦，創刊于2005年，國內統一刊號CN31-1946/R。本刊編輯部現因工作需要，特面向全國招聘編輯一名，該崗位為全日制工作，對該崗位要求如下。

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《組織工程與重建外科》雜志編輯部

Biocompatibility Research of Three-dimensional Printed Polylactic acid/Hydroxyapatite Composite with Bone Marrow Stromal Cells in vitro

ZHANG Haifeng1,DU Zijing1,JIANG Wenbo2,HAN Dong1.1 Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China;2 Shanghai Jiaotong University School of Materials Science and Engineering,Shanghai 200240,China. Corresponding author:HAN Dong(E-mail:handong12000@163.com).

Objective To explore the biocompatibility of three-dimensional printed polylactic acid-hydroxyapatite(3D printed PLA-HA)as the composite scaffolds with bone marrow stromal cells for selecting the suitable scaffold in bone tissue engineering.Methods GPF positive bone marrow stromal cells were seeded on three-dimensional printed polylactic acidhydroxyapatite composite scaffolds and beta-tricalcium phosphate(β-TCP)and then cultured in vitro.The cell adhesion and proliferation were observed by fluorescence microscope,and cell morphology was scrutinized by scanning electron microscopy.Cell Counting Kit 8 (CCK8)were used to test the adhesion rate and proliferation of cells on two kinds of scaffolds at different time points;Alkaline phosphatase(ALP)activity were detected on the third,seventh and fourteenth day.Results Bone marrow stromal cells exhibited the adhesion and proliferation ability well in both three-dimensional printed polylactic acid-hydroxyapatite composite scaffolds and beta-tricalcium phosphate;The adhesion rate in β-TCP group was higher than in PLA-HA group(P<0.05),while the adhesion rate in PLA-HA group was still more than 60%after cultured for 12 hours;The amount of cell proliferation (the value of OD)4 and 7 days after culture in PLA-HA group were both higher than in β-TCP and control group respectively(P<0.05)in vitro.The secretion of ALP 7 and 14 days after culture in groupPLA-HA as well as β-TCP were both higher than in control group 3 (P<0.05).Meanwhile,the ALP secretion in PLA-HA group was higher on the third day compared with β-TCP group(P<0.05).Conclusion Three-dimensional printed polylactic acid-hydroxyapatite composite scaffolds present good biocompatibility in vitro and it can be selected as biomaterials in bone tissue engineering.

Three-dimensional printing; Bone tissue engineering; Polylactic acid;Hydroxyapatite; Bone marrow stromal cells

Q813.1+2

A

1673－0364（2015）06－0349－05

10.3969/j.issn.1673-0364.2015.06.001

2015年9月16日；

2015年11月3日）

國家自然科學基金項目（81272132）。

200011 上海市 上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院整復外科（張海峰，杜子婧，韓冬）；200240 上海市 上海交通大學材料科學與工程學院（姜聞博）。

韓冬（E-mail：handong12000@163.com）。