丹瓜方干預ApoE^-/-糖尿病模型小鼠腦組織IGF-1表達研究

顏群芳，陳依楚，黃蘇萍*，衡先培，陳 燕，李 亮，王思梅，康文倩，陳超云，葉夢捷，鄭滬琳

(1.福建中醫藥大學，福州350122;2.福建中醫藥大學附屬人民醫院，福州350004;3.杭州市余杭區第一人民醫院，浙江杭州311100)

糖尿病腦病(diabetic encephalopathy，DE)是糖尿病慢性并發癥之一，主要表現為認知功能障礙、癡呆、精神性疾患等慢性腦病癥狀。胰島素樣生長因子-1(IGF-1)是一類結構上與胰島素部分同源的多肽，能促進細胞生長并具有胰島素樣代謝效應。有研究顯示，IGF-1可能參與了糖尿病腦病的發生發展過程［1-4］。既往研究表明，丹瓜方能改善糖尿病模型大鼠胸主動脈超微形態學變化、保護血管［5］;拮抗高糖的細胞毒性［6］;消除高糖對細胞正常生長周期的不良影響［7］;并能顯著降低血糖、血脂，下調氧化應激［8］。本研究將探討丹瓜方對糖尿病模型小鼠腦組織IGF-1表達的影響，初步揭示丹瓜方防治糖尿病腦病的部分機制。

1 實驗材料

載脂蛋白E(Apo E)基因敲除小鼠(Apo E^-/-)，雄性，8周齡，SPF 級，60 只，體質量(21 ±2)g，購買于北京大學醫學部，系美國Jackson實驗室引進。并同時購入與上述小鼠同品系的同齡、同性別C57小鼠15只，體質量(22±2)g。許可證編號:SCXK(京)2011-0012。分籠飼養于SPF級動物房內。環境溫度:(22±1)℃;濕度:50% ±5%;12 h/12 h明暗周期。動物食用標準顆粒飼料，自由飲水和攝食。飲用水為清潔自來水，飼料由福建省醫學科學研究所實驗動物中心提供并經高溫消毒與輻射照射處理。丹瓜方(由丹參、瓜蔞、川芎、郁金、薤白、赤芍藥、白僵蠶等組成)由福建中醫藥大學附屬人民醫院藥劑科生產，原生藥2 g/mL藥液，批號:120928。鹽酸吡格列酮由日本武田藥品工業株式會社生產、天津武田藥品有限公司分裝，產品批號:153B。鏈脲佐菌素(STZ)，Simga公司，批號:S8050。IGF-1酶聯免疫法試劑盒，上海西唐生物科技有限公司。LMQ.C80E全自動高壓滅菌鍋，山東新華醫療器械股份有限公司。LX-200離心機，海門市其林貝爾儀器。DK600S三用水浴恒溫箱，上海精宏實驗設備有限公司。ELX800全自動酶標儀，美國BioTek公司。

2 造模方法

連續稱取小鼠空腹狀態下的體質量3 d，以第3天體質量為準，40 mg/kg鏈脲佐菌素(STZ)，于清晨空腹腹部皮下注射，連續3 d。最后1次注射后48、72 h分別測定空腹血糖(FBG)，選出2次血糖值都≥11.1 mmol/L者，余下鼠再同法注射STZ2 d，并測定血糖，選出全部2次FBG≥11.1 mmol/L的Apo E^-/-小鼠視為糖尿病成模鼠。為了減少分組后灌胃失敗所導致的動物減員，將成模鼠適應性灌胃觀察1周。期間有2只鼠因灌胃失敗死亡。

3 實驗方法

3.1 分組及干預方法 在測定基礎血糖次日測定糖尿病成模鼠空腹狀態下的體質量，按體質量分層，再按血糖水平由高至低，按隨機數字表法，隨機分為模型組［無菌水，15 mL/(kg·d)］、丹瓜方組［丹瓜方15 mL/(kg·d)］、吡格列酮組［4.3 mg/(kg·d)］、聯合用藥組［吡格列酮4.3 mg/(kg·d)+丹瓜方15 mL/(kg·d)］，每組8只。以上用藥量都由60 kg成人每日常規用藥量按照小鼠用藥量公式［(動物體質量/人的體質量)×人的劑量×8.65］計算而來。15只C 57小鼠連續測定FBG 2 d，計算2次血糖的平均值。選出血糖值正常的8只鼠作為對照。均以常規飼料喂養。根據前期預實驗干預12周后，禁食但不禁水12 h取標本。

3.2 檢測指標及方法 觀察小鼠活動情況、精神狀態及皮毛光澤度。每2周稱取小鼠空腹體質量。12周后禁食12 h，摘除右眼球取血，小鼠取血后迅速拉尾斷頸，置于冰上操作，迅速開顱取腦組織，盛于1.5 mL離心管并放入液氮凍存備用。

酶聯免疫吸附測定(ELISA)法檢測IGF-1的表達，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

3.3 統計學方法 運用SPSS 20.0軟件，計量資料屬正態分布者用均數±標準差(珋±s)表示，多樣本均數兩兩比較采用單因素方差分析，方差齊采用LSD法。方差不齊者經對數轉換，方差齊后再用LSD比較。

4 實驗結果

見表1。

表15 組小鼠干預12周后IGF-1比較(珋±s，n=6)

表15 組小鼠干預12周后IGF-1比較(珋±s，n=6)

注:與C57比較:ΔP ＜0.05，ΔΔP ＜0.01;與模型組比較:□□P ＜0.01;與丹瓜方組比較:##P ＜0.01

組 別 IGF-1(ng/mL)C57 組 19.89 ±0.95模型組 7.25 ±0.42ΔΔ丹瓜方組 14.31 ±0.99ΔΔ□□聯合用藥組 11.58 ±0.92ΔΔ□□##吡格列酮組 8.38 ±0.90ΔΔ

5 討論

糖尿病腦病(DE)是糖尿病慢性并發癥之一，以獲得性認知和行為缺陷為特點［9-10］。糖尿病的高血糖狀態或內在的代謝紊亂介導氧化應激、線粒體功能障礙、內質網應激誘導海馬神經細胞凋亡［11-12］。已有前瞻性臨床研究表明［13］，IGF軸可能對糖尿病風險產生影響。其中IGF-1是重要因素。IGF-1能刺激肌肉組織中蛋白質合成;促進游離脂肪酸的利用;改善糖尿病病人胰島素抵抗;生理劑量間接抑制生長激素的分泌，超過生理劑量抑制胰島素分泌;并聯合胰島素、生長激素對糖、脂肪、蛋白質代謝中間環節產生直接影響。但在糖尿病患者中，IGF-1活性明顯異常［14-18］。

糖尿病屬中醫氣血津液病證，為慢性疾患。病久入絡，血脈瘀滯，且陰虛內熱，耗傷津液，痰濁內生，痰瘀互結。糖尿病的防治向來著手于血糖、血脂的調控。ACCORD等詢證醫學證據表明，嚴格的強化降糖、降脂無益于降低糖尿病心血管風險［19］。丹瓜方由丹參、瓜蔞、赤芍、郁金、川芎、白僵蠶、薤白等組成，全方清潤通絡、痰瘀同治。本研究揭示，IGF-1在糖尿病小鼠腦組織中表達降低，丹瓜方能適度上調腦組織中IGF-1的表達水平，其作用亦較吡格列酮顯著。

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