基于HS—SPME的超聲波輔助提取香椿揮發性成分工藝優化

楊慧+王趙改+史冠瑩+梁萬平+王曉敏+張樂

摘 ? ?要：以中牟棚栽紅油香椿嫩芽為試驗材料，基于頂空固相微萃取技術（HS-SPME），采用單因素分析結合正交試驗對超聲波輔助萃取香椿風味物質進行工藝優化，并對萃取物揮發性成分進行分析研究。結果表明，在頂空固相微萃取最優條件為萃取頭50/30 μm DVB/CAR/PDMS、萃取溫度40 ℃、萃取時間30 min的基礎上，超聲波輔助乙醚法最佳條件為：料液比1∶2，萃取功率240 W，提取溫度40 ℃，提取次數3次。風味物質檢測結果顯示，超聲波輔助聯合頂空固相微萃取法（HS-SPME-UWE-C2H5OC2H5）檢測出風味物質69種，比HS-SPME法多6種;HS-SPME-UWE-C2H5OC2H5法含量最高的為芳香族/烴類物質（41.83%）和萜烯類物質（22.10%），HS-SPME法則是醛類物質（34.57%）、萜烯類物質（21.88%）和噻吩類物質（12.75%）。

關鍵詞：香椿;頂空固相微萃取;超聲波

中圖分類號：S644.4 ? ? ? ? 文獻標識碼：A ? ? ? ? DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.11.013

Process Optimization of Extracting Toona sinensis Volatiles based on HS-SPME and Ultrasonic-Assisted

YANG Hui1， WANG Zhao-gai1， SHI Guan-ying1， LIANG Wan-ping2， WANG Xiao-min1， ZHANG Le1

（1.Institute of Agricultural Products Processing， Henan Academy of Agricultural Sciences， Zhengzhou， Henan 450008， China; 2. Institute of Resources and Environment， Zhumadian Academy of Agricultural Sciences， Zhumadian， Henan 463000， China）

Abstract： The Toona sinensis volatiles ultrasonic-assisted extraction process was optimized by single-factor and orthogonal tests based on HS-SPME，and the flavor of extractant was analyzed. The result showed that the optimum conditions of ultrasonic-assisted extraction were as follows： material-to-liquid ratio 1∶2， extraction power was 240 W， temperature 40 ℃，3 times extraction， which was based on 50 / 30 μm DVB/CAR/PDMS as extracting head， temperature 40 ℃and extraction time 30 min of HS-SPME. Flavor compounds showed that 69 species were detected in extractant by ultrasonic-assisted， which was 6 species more than HS-SPME. Aromatic / hydrocarbons （45.92%） and terpenes substances （24.26%） were the main materials in extractant by UWE-C2H5OC2H5 ， while the content of aldehydes （38.14%）， terpenoids （24.14%） and thiophene material （14.07%） was high by HS-SPME.

Key words： Toona sinensis; HS-SPME; ultrasonic

香椿為我國特種資源，其風味獨特、營養豐富、味道鮮美，深受廣大消費者喜愛[1]。隨著香椿蔬菜化栽培的推廣，科研人員在選育[2]、繁殖[3]、栽培[4]、采后保鮮[5-6]及貯藏運輸等方面開展了廣泛研究，雖然香椿獨特誘人的香味是衡量其食用價值和商業價值重要品質特性，然而，受技術條件限制，香椿風味物質的研究卻較滯后。近年來，隨著現代分析手段的發展，關于香椿風味物質萃取的研究日益增多[7-11]，其中有機溶劑萃取法因其操作簡單、簡便易行、能較真實地反映抽提對象的香氣組成等優點，成為常用方法之一[12]。陳從瑾等[13]曾用乙醚超聲波法（UWE-C2H5OC2H5）提取香椿干粉中揮發油，得到暗綠色稠狀物，此外關于有機試劑法萃取香椿，特別是新鮮香椿風味物質的研究甚少。然而，在實際操作過程中，利用超聲波輔助乙醚萃取新鮮香椿嫩芽揮發性成分時，發現萃取物也呈墨綠色粘稠狀。根據前人研究，香椿中揮發性化合物復雜多樣且研究有限，有成分尚未鑒定出。若貿然直接用GC-MS檢測，對儀器和柱子是否有損傷尚不可知。

鑒于此，本試驗利用超聲波輔助乙醚提取技術協同頂空固相微萃取（HS-SPME-UWE-C2H5OC2H5），對新鮮香椿嫩芽揮發性成分進行分離提取，以期為香椿揮發性成分提取提供一種新思路和方法，同時也解決香椿萃取物呈粘稠狀且成分復雜對柱子造成不可估量的影響這一難題，具有理論和實踐雙重意義，有助于推動香椿產業向廣、深方向發展。

1 材料和方法

1.1 材 ?料

供試品種為棚栽紅油香椿，于2015年3月中旬采自河南省鄭州市中牟縣田莊村河南省農業科學院香椿示范基地，選取新鮮、健壯、成熟度相對一致、無病蟲害和機械損傷的香椿嫩芽進行粉碎后試驗。

1.2 儀器與設備

7890AGC -5975CMS 型氣相色譜—質譜聯用儀，美國安捷倫公司;HP-5MS石英毛細管色譜（30 m×0.25 μm×0.25 μm）;頂空固相微萃取裝置（包括手持式手柄，50/30 μm DVB/CAR/PDMS、65 μm PDMS/DVB、75 μm CAR/PDMS 萃取頭，40 mL棕色頂空瓶），美國安捷倫公司。

1.3 GC-MS分析條件

GC條件：HP-5MS石英毛細管柱（30 m×250 μm×0.25 μm）;載氣He，進樣口溫度250 ℃，無分流比;柱流速1 mL·min-1;程序升溫：初溫40 ℃，保持3 min，以5 ℃·min-1的速率升溫至150 ℃，保持2 min;以8 ℃·min-1的速率升至220 ℃，保持5 min。

MS條件：穿梭線溫度230 ℃，電離方式為電子電離（EI），離子阱溫度230 ℃，掃描方式全掃描，掃描范圍m/z 43～800。檢索圖庫：NIST 2.0。

1.4 ?試驗方法

1.4.1 頂空固相微萃取法條件優化 （1）萃取流程。新鮮香椿、切碎→稱取1.0 g于40 mL棕色頂空瓶里→密封墊密封→40 ℃水浴中平衡15 min→萃取頭插入頂空瓶中，萃取30 min→立即取出，插入GC-MS解析5 min[11]。 （2）萃取條件優化單因素試驗。采用單因素逐步優化的方法對萃取頭、萃取時間、萃取溫度進行優化[1]。采用萃取頭類型有50/30 μm DVB/CAR/PDMS、65 μm PDMS/DVB、75 μm CAR/PDMS 3種;采取萃取溫度有10，20，30，40，50 ℃等5個梯度;采用萃取時間有5，15，30，45，60 min 5 個梯度。根據不同梯度色譜峰的總面積確定最佳的萃取溫度、萃取時間、萃取頭類型。

1.4.2 ?HS-SPME-UWE-C2H5OC2H5法工藝優化 基于頂空固相微萃取最佳條件，優化超聲波輔助乙醚萃取法。

（1）工藝路線。新鮮香椿、粉碎→加乙醚，超聲萃取30 min→倒出濾液并合并→加入無水Na2SO4干燥過夜→5 000 r·min-1離心20 min→上清液揮去乙醚→萃取物→頂空瓶→頂空固相微萃取→GC-MS。

（2）工藝參數優化。以色譜峰的總面積為響應值，進行單因素和正交試驗。

① 超聲波輔助乙醚萃取法考察料液比、超聲波功率、提取溫度、萃取次數5個單因素，設計如下。

A：料液比設1∶0.5、1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5等5個水平;

B：超聲波功率設60、120、180、240、300 W等5個水平;

C：提取溫度設10、20、30、40、50 ℃5個水平;

D：萃取次數設1、2、3、4、5次5個水平。

② 在單因素試驗的基礎上，選取料液比、功率、溫度、萃取次數4個因素和3個水平，以總峰面積為響應值進行L9（34）正交試驗，確定最佳工藝參數。

2 結果與分析

2.1 頂空固相微萃取條件優化

2.1.1 萃取頭的優化 根據極性及涂層厚度的不同，選取50/30 μmDVB/CAR/PDMS、65 μm PDMS/DVB、75 μm CAR/PDMS 3種萃取頭進行優化，結果如圖1所示。50/30 μm DVB/CAR/PDMS檢測出色譜峰數量和面積明顯比其它高，表明該類型萃取頭具有較大萃取效率。

2.1.2 ?萃取溫度的優化 在最優萃取頭基礎上進行萃取溫度的優化，如圖2所示，總峰面積隨萃取溫度的升高而上升，在萃取溫度為40 ℃時，總峰面積最大，為17.7×108，隨后當萃取溫度升高到50 ℃時，總峰面積降低，推測可能是部分含硫化合物、萜烯類化合物熱不穩定的成分分解造成的[1]。

2.1.3 ?萃取時間的優化 在最優萃取頭、萃取溫度的基礎上進行萃取時間的優化，如圖3所示，在5～30 min區間內，峰面積隨著萃取時間的延長逐漸增大，隨后基本保持不變，表明萃取30 min已達到最大萃取效率，故選30 min是最佳萃取時間。

2.2 HS-SPME-UWE-C2H5OC2H5法工藝優化

2.2.1 單因素試驗 料液比、提取功率、提取溫度、萃取次數對總峰面積的影響分別如圖4所示。圖4a中，隨著料液比的增大，總峰面積逐漸升高，并在料液比1∶1.5時達到最大，隨后變化不大。顯示料液比1∶1.5比較合適。圖4b中，總峰面積隨著超聲波功率的增大而增大，在240 W時達到最大值，隨后略有下降趨勢。故選擇功率為240 W較為合適。圖4c中，總峰面積隨著萃取溫度的升高逐漸上升，40 ℃以后總峰面積變化不大，達到最大萃取效率。圖4d中，總峰面積對萃取次數的增大逐漸增大，當萃取次數達3次時，總峰面積達到最大，之后達到動態平衡，此時達到最大萃取效率。

2.2.2 正交試驗 在單因素最佳條件的基礎上，進行4因素3水平L9（34）正交試驗，結果見表1。超聲波輔助乙醚法最佳條件為A3B2C2D3，即料液比1∶2，提取功率240 W，提取溫度40 ℃，提取次數3次。由極差知， 影響香椿風味物質因素的主次順序為： A>C>B>D，即料液比>萃取溫度>功率>萃取次數。

2.3 HS-SPME-UWE-C2H5OC2H5法萃取香椿風味物質分析

2.3.1 香椿風味物質成分鑒定結果 ① 在最優萃取條件的基礎上，超聲波輔助乙醚協同頂空固相微萃取香椿風味物質總離子的流圖如圖5a所示，圖5b為頂空固相微萃取法總離子流圖，兩種方法的對比分析結果見表4。經鑒定，超聲波輔助乙醚聯合頂空固相微萃取法檢測出風味物質為69種，比單純用頂空固相微萃取法多檢測出6種，更是比陳叢瑾等[13]用乙醚超聲波提取揮發油種類多出30種。

② 兩種方法檢測出15種共有物質，分別為2-己烯醛、2，4-二甲基噻吩、石竹烯、2，6，6三甲基-1-環己烯-1-甲醛、古巴烯、[1S-（1π4π7π]-1，2，3，4，5，6，7，8-八氫-1，4-二甲基-7-（1-異丙烯基）-薁、π石竹烯、4-亞環己基-3，3二乙基-2-戊酮、[4aR-（4aπ7π8aπ]-十氫-4a-甲基-1-亞甲基-7-（1-異丙烯基）-萘、[2R-（2π4aπ8aπ]-1，2，3，4，4a，5，6，8a-八氫-4a，8-二甲基-2-（1-甲基乙烯基）- 萘、[1S-（1π3π3aπ4π8aπ]-十氫-1，5，5，8a-四甲基-1，4-Methanoazulen-3-醇、π愈創木烯、5，6，7，7a四氫化-4，4，7a三甲基-2（4H）苯并呋喃酮、1-Heptatriacotanol和喇叭烯氧化物-（II）。

③ HS-SPME-UWE-C2H5OC2H5法萃取香椿風味物質中含量最高的10種物質是1-甲基-4-（1甲基乙基）苯（7.53%）、十一烷（7.2%）、石竹烯（7.01%）、（Z）-3-十一碳烯（6.3%）、1-乙基-3-甲基-苯（6.07%）、薄荷烷（5.49%）、2-十二碳烯-丁二酸酐（3.415%）、十二烷（3.11%）、2.6.10-三甲基正十四烷（3.1%）和2，4-二甲基噻吩（3.05%）;HS-SPME法含量最高的物質是2-己烯醛（5.16%）、2，4-二甲基噻吩（10.69%）、苯甲醛（27.2%）和π石竹烯（3.16%）。此外，HS-SPME法含有HS-SPME-UWE-C2H5OC2H5法所缺少的2-硫基-2-3二氫3，4-二甲基-噻吩（2.06%）。

2.3.2 香椿風味物質種類的構成 香椿萃取物風味物質可以分為以下幾類：醛類、噻吩類、萜烯類、醇類、酮類、硫醇類等。2種方法萃取香椿風味物質種類組成相對含量圖如圖6所示，HS-SPME-UWE-C2H5OC2H5法含量最高的為芳香族/烴類物質（41.83%），其次是萜烯類物質（22.10%）;HS-SPME法含量最高的則為醛類物質（34.57%），其次為萜烯類物質（21.88%），最后為噻吩類物質（12.75%）。

3 結論與討論

（1）基于最優頂空固相條件，萃取頭為50/30 μm DVB/CAR/PDMS，萃取溫度40 ℃、萃取時間30 min，超聲波輔助乙醚法最佳條件為料液比1∶2，萃取功率240 W，提取溫度40 ℃，提取次數3次。

（2）HS-SPME-UWE-C2H5OC2H5和HS-SPME法萃取的風味物質中均含有2，4-二甲基噻吩，但HS-SPME法還含有2-巰基-2，3-二氫-3，4-二甲基噻吩。張杰等的研究表明，2-巰基-2，3-二氫-3，4-二甲基噻吩即為香椿特征香氣成分物質，推測在超聲波乙醚提取的過程中，2-巰基-2，3-二氫-3，4-二甲基噻吩性質不穩定，是失去巰基（-H2S）造成的。另外，試驗檢測出的2，4-二甲基噻吩與張杰等檢測出的3，4-二甲基噻吩等物質不一樣，但可以看出它們互為同分異構體，推測所呈現出來的味道相差不大，有類似于煮熟的洋蔥味和硫磺味，其具體生產機理還需進一步研究。

（3）HS-SPME-UWE-C2H5OC2H5法與陳叢瑾檢測揮發物質分析研究結果相比，存在5種共有物質，分別是古巴烯、石竹烯、紅沒藥烯、4，4，7a-三甲基-5，6，7，7a-四氫-2（4H）-苯并呋喃酮與愈創木烯。兩法主要物質不同，HS-SPME-UWE-C2H5OC2H5法檢測的主要物質是芳香/烷烴和萜烯類，而超聲波輔助乙醚法為未知物、棕櫚酸、亞油酸及其氧化物等。此外，物質香氣不僅取決于成分的種類和含量，還與其感覺閾值和相互作用密切相關[14]，HS-SPME-UWE-C2H5OC2H5法提取的風味物質中存在超聲波輔助乙醚法中缺少的2，4-二甲基噻吩，該物質的氣味強度僅次于香椿特征香氣，閾值較高。

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