扶正活血中藥對放射性肺損傷大鼠肺組織ET—1表達影響的實驗研究

鄭海紅 甘梅富 魏科娜 翁壽向 徐鋮 葛震

中醫(yī)科，浙江臨海 317000

[摘要] 目的 觀察放射性肺損傷大鼠肺組織內(nèi)皮素-1（Endothelin-1，ET-1）的變化情況，探討扶正活血中藥在放射性肺損傷防治用途中的作用及其可能機制。 方法 56只SD雌性大鼠隨機分為模型組（14只）、前期干預(yù)組（14只）、后期短程干預(yù)組（14只）和后期長程干預(yù)組（14只）4組，通過單次大劑量胸部照射制成放射性肺損傷大鼠模型，并用扶正活血中藥進行干預(yù)，于照射后3個月、6個月兩個時間點隨機處死各組大鼠7只，取各組大鼠肺組織進行免疫組化檢測ET-1蛋白表達水平。 結(jié)果 各干預(yù)組肺組織ET-1蛋白表達水平明顯低于模型組。 結(jié)論 血漿ET-1水平的變化情況在某種程度上能反映放射性肺損傷的嚴重程度，扶正活血中藥能抑制肺組織ET-1的表達，可能是扶正活血中藥治療放射性肺損傷的一個作用機制。

[關(guān)鍵詞] 放射性肺損傷；扶正活血中藥；內(nèi)皮素-1

[中圖分類號] R289.9 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2015）29-0026-03

Experimental study of the effect of Fuzheng Huoxue recipe on the expression of ET-1 in rats with radiation-induced lung injury

ZHENG Haihong1 GAN Meifu1 WEI Ke'na1 WENG Shouxiang1 XU Cheng1 GE Zhen2

1.Department of Pathology， Taizhou Enze Medical Center， Taizhou Hospital of Zhejiang Province， Linhai 317000， China； 2.Department of traditional chinese medicine， Taizhou Hospital of Zhejiang Province， Linhai 317000， China

[Abstract] Objective To observe the effect of Fuzheng Huoxue recipe on the expression of ET-1 in rats with radiation-induced lung injury，and discuss the prevention and curative effect of Fuzheng Huoxue recipe and its possible action mechanism. Methods 56 S-D rats were randomly allocated into irradiation group（n=14）， irradiation with early intervention group （n=14）， irradiation with short post-intervention group （n=14）， irradiation with long-term post-intervention group （n=14）， All groups were irradiated all chest with a single large dose . 7 rats in all groups were put to death at the end of the 3th， 6th month after the irradiation， then immunohistochemistry was used to assayed the levels of ET-1 in lung. Results The protein expression of ET-1 in Fuzheng Huoxue recipe-treated groups were significantly lower than that of the model group. Conclusion ET-1 could reflect the degree of radiation lung injury. Fuzheng Huoxue recipe could degrade the levels of ET-1 in lung tissues significantly. It might be one of their mechanisms in treatment of radiation-induced lung injury.

[Key words] Radiation-induced lung injury；Fuzheng Huoxue recipe；ET-1

放射治療是治療胸部惡性腫瘤的主要手段之一，例如在肺癌、乳腺癌及食管癌等胸部腫瘤的放射治療中，部分肺組織可能或多或少受到一定劑量的射線照射因而引起不同程度的放射性損傷，依疾病進展可以分為早期的放射性肺炎和后期的肺纖維化[1-6]。目前尚未完全闡明放射性肺損傷產(chǎn)生的機制，目前多數(shù)研究表明放射性肺損傷與多種因子過度表達相關(guān)[7-11]。內(nèi)皮素-1（Endothelin-1，ET-1）被看作為生物活性肽中的一種[12-14]，在特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化的發(fā)病過程中起一定作用，關(guān)于ET-1在放射性肺損傷中作用的相關(guān)文獻尚不多見[15]。本實驗通過建立放射性肺損傷動物模型，采用免疫組織化學(xué)方法檢測ET-1在肺組織的表達，初步研究扶正活血中藥在放射性肺損傷防治用途中的作用及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料來源

實驗動物：56只健康成年清潔級SD雌性大鼠， 體重（200±10）g，購買于由溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，于清潔動物房常規(guī)飼養(yǎng)3 d后，觀察無異常者方能入組實驗。ET-1多克隆兔抗體濃縮液購自博士德公司。

1.2 方法

1.2.1 分組 56只成年清潔級SD雌性大鼠，隨機分為4組：模型組（單純放射損傷）、前期干預(yù)組（放射前2周連續(xù)給藥）、后期短程干預(yù)組（前期不做中藥干預(yù)，放射后連續(xù)給藥1個月）、后期長程干預(yù)組（前期不做中藥干預(yù)，放射后連續(xù)給藥3個月），每組14只。

1.2.2 模型制備 所有動物采用1%戊巴比妥鈉（0.3 mL/100 g）腹腔內(nèi)注射麻醉后，取仰臥位固定在特制木架上，充分暴露胸部范圍，采用6MV-X線加速器設(shè)備，單次全胸照射劑量25 Gy，照射面積約3.5 cm×4.0 cm（上至兩腋窩、下至胸骨及劍突，其余部分應(yīng)用10 cm厚鉛磚屏蔽），照射距離為100.0 cm，劑量率為320 cGy/min。

1.2.3 中藥制備及給藥方式 扶正活血法基礎(chǔ)方由紅景天、川芎、生黃芪、黨參、生地黃、丹皮、白術(shù)、炙甘草、茯苓、丹參、當歸、赤芍、靈芝和南沙參等常用中藥組成，所用藥物由臺州醫(yī)院中藥房檢驗合格后提供，在中藥房制劑室常溫低壓水煎濃縮成3.14 g/mL生藥濃度的藥液備用（中藥換算方法以成人按60 kg體重一日劑量與大鼠平均250 g體重10倍系數(shù)換算）。每日每只動物3 mL灌胃一次。模型組：單純放射損傷，前期及后期均不用中藥干預(yù)；前期干預(yù)組：放射前2周連續(xù)給予扶正活血湯中藥灌胃，放射后不做干預(yù)治療；后期短程干預(yù)組：前期不做中藥干預(yù)，放射后給予扶正活血湯連續(xù)灌胃1個月；后期長程干預(yù)組：前期不做中藥干預(yù)，放射后給予扶正活血湯連續(xù)灌胃3個月。

1.2.4 取材 分別在放射后3個月、6個月兩個時間點隨機抽取并處死7只大鼠，迅速剖開其胸腔，剪斷左右主支氣管，取大鼠右肺中葉，固定于10%的甲醛溶液中，石蠟包埋組織以4 μm厚連續(xù)切片，行免疫組化檢測ET-1的表達水平。

1.2.5 免疫組織化學(xué)方法 所有手術(shù)切除標本均經(jīng)4%中性甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋。免疫組化采用EnVision法，具體操作步驟嚴格按試劑說明書進行（以1∶100稀釋），抗原修復(fù)采用高壓鍋高溫修復(fù)，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，乙醇脫水、透明、中性樹膠封固，鏡下觀察。以PBS代替一抗作為陰性對照。光鏡下觀察胞漿中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，顏色越深表達越強。

1.3 觀察指標

觀察各組大鼠肺組織中ET-1 蛋白表達情況。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析，計數(shù)資料進行χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

正常肺組織ET-1 在支氣管黏膜上皮，血管平滑肌以及其周圍間質(zhì)，肺泡上皮細胞及肺泡巨噬細胞有灶狀陽性表達。模型組照射后ET-1在支氣管上皮、肺巨噬細胞、上皮細胞、炎癥細胞處陽性表達細胞數(shù)增多，有的陽性表達細胞連成一片，表達程度逐漸增強，血管平滑肌及其周圍ET-1染色陽性從血管內(nèi)皮細胞一直至血管周圍。中藥干預(yù)各組均見ET-1呈弱陽性表達（表1、封三圖2～5），模型組、前期干預(yù)組、后期短程干預(yù)組、后期長程干預(yù)組ET-1的陽性率分別為100.0%（14/14）、64.3%（9/14）、64.3%（9/14）、50.00%（7/14），中藥干預(yù)各組與模型組之間兩兩比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

表1 各組ET-1陽性率

注：b vs a，χ2=6.0870，P=0.0136；c vs a，χ2=6.0870，P=0.0136；d vs a，χ2=9.3333，P=0.0023

3 討論

本實驗采用全肺單次照射造模，引起實驗性大鼠的肺放射性損傷，并用扶正活血中藥進行干預(yù)治療，結(jié)果表明扶正活血中藥能明顯減輕肺水腫發(fā)生程度和炎癥細胞滲出程度，效果較好。中醫(yī)學(xué)認為，射線是熱毒之邪毒，可損傷人體之正氣及陰血。從癥狀上看，急性放射性肺炎屬于咳、喘范疇，其發(fā)病機制為肺熱血瘀、氣陰兩傷、宣肅失司[16]。

中藥現(xiàn)代藥理研究黃芪、川芎、黨參和當歸等具有提高機體免疫力、抑制血小板凝集、促進骨髓造血功能、抗氧化和清除自由基、提高肺表面活性物質(zhì)、非特異性抗炎等作用[17-21]。本研究以扶正療法為主，大補元氣，使機體的正氣增強，增強抵抗放射性損傷的能力，從而減輕放射性損傷的程度、減少放射性損傷的發(fā)生率。

肺是機體ET-1最重要的合成、代謝及作用的靶器官之一。研究結(jié)果證明ET-1具有加重及促進肺纖維化的雙重作用[22]。ET-1能明顯提高成纖維細胞的促有絲分裂作用，促使成纖維細胞DNA合成，加速細胞的增殖進程，而且可促進成纖維細胞合成I型膠原[23-24]。一些研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)ET-1水平與肺纖維化嚴重程度和臨床表現(xiàn)有一定程度的相關(guān)性。

本實驗結(jié)果顯示在照射后3個月，模型組肺組織中的ET-1呈強陽性表達，而中藥干預(yù)各組均見ET-1呈弱陽性表達，表明隨著放射性肺損傷的加重，肺組織ET-1表達會增強，提示ET-1水平能反映放射性肺損傷的嚴重程度。而ET-1主要特異性存在于支氣管黏膜上皮細胞、肺泡巨噬細胞、肺泡上皮細胞、漿細胞及Clara細胞，而正常大鼠肺組織中ET-1樣免疫物質(zhì)極為少見。在本實驗條件下，隨著照射后病程的發(fā)展，ET-1在肺組織表達亦增強，且放射性肺損傷越嚴重，肺組織表達亦越增強，扶正活血中藥能明顯抑制ET-1的表達程度。

綜上所述，扶正活血中藥治療放射性損傷重要環(huán)節(jié)之一是扶正活血中藥能抑制肺組織ET-1的表達，其作用機制尚未完全闡明，有待進一步研究。

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（收稿日期：2015-04-03）