近年無錫市奶牛結核病的流行病學調查

顧舒舒 范鋒（江蘇省無錫市動物疫病預防控制中心 214000）

近年無錫市奶牛結核病的流行病學調查

顧舒舒 范鋒（江蘇省無錫市動物疫病預防控制中心 214000）

結核病是由結核分支桿菌引起的一種人畜共患慢性傳染病。牛結核病主要是由牛分枝桿菌所引起，主要特征為在多種組織器官形成干酪樣壞死、肉芽腫（結核結節）和鈣化結節病變。該病危害嚴重，被國際獸醫局（OIE）列為B類動物疫病[1]，我國列為二類傳染病。本病可經呼吸道、消化道、交配等方式感染。在家畜中，牛最易感染結核病，尤以奶牛多見，其次是水牛和黃牛[2]。近年來，隨著人們生活水平的提高，對奶制品特別是牛奶需求量的增加，帶動了奶牛業的迅猛發展，牛結核病也日益受到了密切關注。目前江蘇省奶牛結核病按照現階段國家動物疫病監測計劃分類標準屬二類地區，奶牛結核病不治療，而采取嚴格的隔離、撲殺患病牛的政策。

牛結核病的檢測方法大體可分為三類：第一類是病原學檢查法，如涂片染色鏡檢、細菌培養等，該法是最確實的方法之一，但由于染色法檢出的細菌只能說明有抗酸桿菌，不能準確鑒定出結核分枝桿菌和非典型分支桿菌，因而缺乏特異性[3]；而細菌培養檢出率低，結核菌生長緩慢，一般需10～30d才能看到菌落[4]，且有10～20%的病例結核菌培養失敗[5,6]，因此，該法在牛結核菌的臨床診斷中不易推廣。第二類是免疫學方法，如皮內變態反應、膠體金和ELISA等方法，PPD皮內變態反應試驗是目前最常用的奶牛結核病檢測方法，我國普遍采用單純頸部皮試變態反應（SCT）進行檢測，歐盟（EU）國家廣泛使用比較皮試變態反應（CCT）進行檢測[7]，而膠體金和ELISA檢測雖然簡單易行，但目前實際價格昂貴，大規模實施的成本過高。第三類是分子生物學方法，如核酸探針、PCR和DNA圖譜等方法，該法需特殊的儀器設備，對實驗室條件以及操作人員的技術要求較高，只適用于實驗室研究，不適用于基層的推廣應用。有報道稱，新型的γ-干擾素（IFN-γ）體外釋放試驗相比SCT和CCT而言，能保持較高的靈敏度和較好的特異性[8]。

于2011～2013年間，對無錫市所有存欄的奶牛進行了奶牛結核病的流行病學調查，本文旨在為無錫市奶牛結核病的診斷和防治提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 儀器

精密電子天平、高速低溫離心機、恒溫培養箱、超凈工作臺、顯微鏡、微量可調移液器、超純化水機、電動推毛剪、微量金屬注射器、注射獸用16#針頭、游標卡尺、酶標儀等。

1.2 試劑與耗材

牛型PPD、禽型PPD購自中國獸醫監察所。BOVIGAMTM試劑盒購自瑞士Prionics公司。

1.3 被檢動物

2011～2013年間，無錫市所有存欄的奶牛，除初生犢牛、懷孕后期母牛及隔離病牛外，其余均為調查對象。

1.4 試驗方法

1.4.1 單純頸部皮試變態反應（SCT）

參照國家標準《動物結核病診斷技術（GB/T18645-2002）》，對無錫市所有存欄奶牛采用SCT進行檢測，使用國產牛型PPD，劑量為2000U（IU）/頭，分別于注射前和注射后72h測量皮膚厚度，并計算出皮厚差，依據國家標準判斷結果，對粗篩和二次復核均為可疑的判定為陽性。

1.4.2 γ-干擾素（IFN-γ）體外釋放試驗

對所有規模奶牛場（存欄100頭以上）隨機挑選部分奶牛，同時采用IFN-γ釋放試驗進行檢測。奶牛尾靜脈無菌采血5ml/頭，將采集的血液置于肝素鈉抗凝管中，輕輕顛倒混勻，使肝素鈉溶解。室溫下將血樣運送到實驗室，在采血后8h內進行刺激培養。將全血樣品無菌分裝至24孔板中，每份血樣分裝3孔，1.5ml/孔。向各孔中分別無菌加入100μl PBS、禽型PPD、牛型PPD，震蕩混勻1min。將含有血液與抗原的24孔板置于37℃濕溫培養箱中孵育24h。次日從各培養孔吸取500μl血漿上清轉入1.5ml離心管中，即為刺激產生的γ-干擾素上清。以Prionics公司購得的試劑盒檢測牛全血上清液中的γ-干擾素，具體操作參照試劑盒說明書進行。

結果判定標準：牛型PPD刺激上清的OD值-PBS刺激上清的OD值≥0.1，且牛型PPD刺激上清的0D值-禽型PPD刺激上清的0D值≥0.1判為陽性；牛型PPD刺激上清的OD值-PBS刺激上清的OD值＜0.1或牛型PPD刺激上清的0D值-禽型PPD刺激上清的0D值＜0.1，則判為陰性。

2 結果

2.1 SCT檢測結果

2011～2013年間，對全市7個區、2個縣的奶牛用SCT檢測奶牛結核病發病情況，共檢測奶牛25613頭次，其中結核陽性奶牛292頭，結核陰性奶牛25321頭次，陽性率為1.14%；2011年共檢測奶牛9020頭，其中結核陽性奶牛147頭，結核陰性奶牛8873頭，陽性率為1.63%；2012年共檢測奶牛8796頭，其中結核陽性奶牛89頭，結核陰性奶牛8707頭，陽性率為1.01%；2013年共檢測奶牛7797頭，其中結核陽性奶牛56頭，結核陰性奶牛7741頭，陽性率為0.72%。檢測結果見表1。

2.2 兩種方法檢測結果

對其中13個規模奶牛場，分別采用SCT和IFN-γ體外釋放試驗同時進行檢測，共計檢測奶牛14000頭次。

SCT檢測結果為：結核陽性奶牛105頭，結核陰性奶牛13895頭次，其中初篩可疑牛15頭次，陽性率0.75%，其中2011年檢測出結核陽性奶牛56頭，結核陰性奶牛3944頭，陽性率1.40%；2012年檢測出結核陽性奶牛34頭，結核陰性奶牛4966頭，陽性率0.68%；2013年檢測出結核陽性奶牛15頭，結核陰性奶牛4985頭，陽性率0.30%。具體結果見表2。

IFN-γ體外釋放試驗檢測結果顯示：ELISA判定陽性奶牛72頭，ELISA判定陰性奶牛13928頭次，陽性率0.51%，其中2011年檢測出結核陽性奶牛45頭，結核陰性奶牛3955頭，陽性率1.13%；2012年檢測出結核陽性奶牛21頭，結核陰性奶牛4979頭，陽性率0.42%；2013年檢測出結核陽性奶牛6頭，結核陰性奶牛4994頭，陽性率0.12%。具體結果見表3。

3 分析與討論

3.1 奶牛結核病的發病情況

2011～2013年間，無錫市奶牛結核病的陽性率呈現逐年降低的趨勢（見圖1）。結核病陽性率從2011年的1.63%降到2012年的1.01%，同比降低了38.04%，2013年的陽性率從2012年的1.01%降至0.72%，同比降低了28.71%，下降幅度逐漸縮小。

圖1 2011～2013年間無錫市奶牛結核病發病情況

表1 2011～2013年間無錫市奶牛結核病SCT監測結果

表2 2011～2013年間無錫市規模奶牛場部分奶牛結核病SCT檢測結果

表3 2011～2013年間規模奶牛場部分奶牛結核病IFN-γ體外釋放試驗檢測結果

通過對奶牛結核病進行定期監測和篩查，對入境奶牛進行嚴格檢疫，及時淘汰病牛，隔離可疑牛，堅持檢疫與淘汰相結合的原則，三年來，無錫市奶牛結核病的發病率在一定程度上得到了控制。結核病陽性率下降幅度逐漸縮小，可能是由于全市奶牛的飼養量逐年減少，同時陽性牛在每年的篩查中被淘汰，結核病傳染的風險降低，因此陽性率在降低的同時，下降幅度也逐漸縮小。

3.2 兩種檢測方法的對比

2011～2013年間，采用SCT和IFN-γ體外釋放試驗兩種方法，對13個規模奶牛場的檢測結果顯示，SCT的陽性檢出率明顯高于IFN-γ試驗，而其陽性、陰性符合數卻低于IFN-γ試驗，因此IFN-γ試驗具有更強的特異性。

IFN-γ體外釋放試驗的陽性數與SCT檢測陽性數的比值呈現逐年減小的趨勢（見圖2），一方面說明SCT檢測法存在較多的假陽性，而IFN-γ體外釋放試驗很大程度上排除了這些假陽性，提高了檢測的準確率；另一方面，由于陽性檢出準確率的提高，陽性奶牛被及時淘汰、撲殺，因此陽性奶牛數逐年減少，陽性率呈現逐年下降的趨勢（見圖3）。

4 結論

2011～2013年間，無錫市奶牛結核病的陽性率總體呈下降趨勢，通過堅持檢疫與淘汰相結合的原則，結核病陽性率的下降幅度也逐漸縮小。調查發現，及時淘汰、撲殺結核病陽性奶牛，對飼養環境進行嚴格消毒，降低奶牛群的飼養密度，加強飼養管理，提高奶牛自身免疫力等措施，可以有效降低奶牛結核病的發病率。經檢測確診為結核病陽性的奶牛被及時撲殺，據統計，三年來共撲殺奶牛292頭。此次調查中發現，多數奶牛結核病檢測陽性的牛為從外地新購入奶牛，在隔離觀察期內未出現明顯癥狀，但SCT和IFN-γ體外釋放試驗均檢測為陽性，因此，下一步要加強調入管理，防止疫病傳入，嚴格執行調入動物審批制度，調入的奶牛經調出地動物衛生監督機構檢測合格的同時，在調入本地后要采取嚴格完善的隔離措施，隔離飼養45d后方可混群飼養。

通過對SCT和IFN-γ體外釋放試驗兩種方法連續三年的檢測結果對比，IFN-γ試驗顯示出了簡單、快捷、靈敏度高、特異性強等特點，使實驗結果更為客觀、可靠，可以有效解決基層動物監督、疫病防控機構在實施奶牛結核病檢疫、隔離、撲殺措施過程中的一系列問題，諸如多次繁瑣的測量觀察，大量的人力物力參與、主觀判定陽性實施撲殺的困難等，因此非常適宜結核病檢疫和監測技術的推廣。但是，IFN-γ試驗仍存在成本較高等問題，且國內目前尚無正規批準試劑盒，但農業部2013年國家動物疫病監測與流行病學調查計劃“對監測陽性的動物，可用外周血IFN-γ體外釋放檢測法（按試劑盒說明書）進行確診”[9]的建議，在本研究的基礎上，將探討采用結核菌素皮內變態反應初篩，初篩陽性或疑似的進行IFN-γ試驗確診的方法。

圖2 IFN-γ體外釋放試驗的陽性數與SCT檢測陽性數的比值

圖3 2011～2013年間無錫市規模奶牛場奶牛結核病的發病情況

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[9]農業部關于印發《2013年國家動物疫病監測與流行病學調查計劃》的通知（農醫發【2013】9 號）.