馬山黑山羊主要疫病病原調查

藍金紅 陶立 李軍 閉炳芬 黃明學 藍顯利 胡萍 馬春霞農啟文 陳澤祥 楊威 韋志鋒 蘭美益 秦若甫

（1，廣西壯族自治區馬山縣動物疫病預防控制中心 530600;2，廣西獸醫研究所 530001;3，廣西畜禽疫苗新技術重點實驗室 530001）

馬山黑山羊主要疫病病原調查

藍金紅1陶立2,3李軍2,3閉炳芬2,3黃明學1藍顯利1胡萍1馬春霞2,3農啟文1陳澤祥2,3楊威2,3韋志鋒2,3蘭美益2,3秦若甫2,3

（1，廣西壯族自治區馬山縣動物疫病預防控制中心 530600;2，廣西獸醫研究所 530001;3，廣西畜禽疫苗新技術重點實驗室 530001）

為了掌握馬山黑山羊主要疫病病原種類，本研究采用現場調查、病原分離培養、血清學檢測、生化特性鑒定、生長抑制試驗、PCR鑒定、動物致病性試驗和蠕蟲學剖解等方法對2013～2014年81例馬山黑山羊病例進行病原學調查。調查結果顯示，細菌感染的病例59例，病毒感染的病例8例，寄生蟲病12例，中毒病2例，主要病原為綿羊肺炎支原體、大腸桿菌、染性膿皰病毒。藥物敏感性試驗結果顯示，分離到的細菌只對環丙沙星、頭孢噻肟、頭孢曲松鈉、左氧氟沙星敏感;而支原體則對壯觀霉素、環丙沙星、卡那霉素、阿米卡星、林可霉素、左氧氟沙星、氟苯尼考高度敏感。本研究結果對馬山黑山羊疫病防控具有一定的指導意義。

黑山羊;疫病;綿羊肺炎支原體;調查

馬山縣位于廣西中南部，地處紅水河南岸，大明山北麓，山多林密，當地飼養的黑山羊因全身黑毛，生長發育快，板肉厚滿，皮毛質軟細小，瘦肉率高，肉質鮮嫩，味美膻氣少，香甜可口，營養價值高等獨特之處，在中國東南沿海一帶及港澳臺地區享有較高聲譽，是專供香港的優質山羊品種。2000年以來，在政府的大力推動下，馬山黑山羊養殖得到迅速發展，但是，隨著飼養規模的擴大、養殖方式的轉變以及養殖戶缺乏疫病防控知識，黑山羊疫病的發生逐年增多，給養殖戶造成嚴重的經濟損失，嚴重制約了黑山羊產業的健康發展[1,2]。為此，我們于2013～2014年對馬山黑山羊開展疫病調查，摸清疫病種類，以期為其防控提供依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病料

檢測樣本采集自81個病例的羊肺、肝、腎、淋巴結、痘疹結節、痂皮、胸腔積液、膿汁、小腸內容物、直腸糞便或糞便拭子等。

1.1.2 試驗動物

未免疫過羊支原體疫苗的15kg左右黑山羊購自馬山縣個體養殖戶；20g左右昆明種小白鼠購自廣西醫科大學實驗動物中心。

1.1.3 試劑和儀器

PPLO肉湯購自杭州百思生物技術有限公司。馬血清購自廣東蕊特生物科技有限公司。TSA瓊脂和TSB培養基購自北京陸橋技術有限責任公司；麥康凱瓊脂、營養瓊脂和TSI瓊脂購自廣東環凱生物科技有限公司；馬丁湯、兔血瓊脂培養基為廣西獸醫研究所細菌室制。衣原體微量血清診斷試劑盒、綿羊肺炎支原體Y98型凍干陽性血清和絲狀支原體山羊亞種PG3型凍干陽性血清購自蘭州獸醫研究所。大腸桿菌血清定型試劑盒購自中國獸醫藥品監察所。細菌微量生化鑒定管和藥敏試紙片購自杭州天和生物技術有限公司細菌基因組DNA提取試劑盒、病毒基因組提取試劑盒、PCRTaqMix等分子生物學試劑購自康為世紀生物科技有限公司。PCR儀購自日本TaKaRa公司，凝膠成像系統購自美國AlphaInotech公司。

1.2 方法

1.2.1 支原體的分離和鑒定

無菌取病羊肺組織1小塊，加5ml培養液勻漿，4000r/min離心15min，取適量肺組織上清液或胸腔積液接種到含20%馬血清PPLO肉湯培養基中，置37℃含5%CO2培養箱中培養5～7d，并盲傳2～3代，發現24h后才開始變黃且液體透亮的培養物，經0.45μm細菌濾器過濾后，按10%（v/v）的接種量將濾液加入到含20%馬血清PPLO肉湯培養基中繼續傳1～2代，若傳代培養基仍然變黃，可在PPLO固體培養基上劃線，37℃培養，倒置于顯微鏡上，在40×光學顯微鏡下觀察菌落的生長和形態。挑取單個菌落涂于載玻片上，火焰固定，分別作革蘭氏和姬姆薩-瑞氏染色，光學顯微鏡下觀察其染色形態。按陶立等（2012）和儲岳峰等（2009）方法進行支原體的生長抑制試驗和PCR鑒定[3,4]。

1.2.2 細菌的分離和鑒定

取病變組織分別接種TSA瓊脂培養基、麥康凱瓊脂培養基、TSI瓊脂培養基、馬丁湯和兔血瓊脂培養基，37℃培養24～48h，挑取單個菌落涂于載玻片上，火焰固定，革蘭氏染色，光學顯微鏡下觀察染色形態。按陳澤祥等（2008）方法進行細菌16SrRNA基因的PCR擴增和鑒定[5]。PCR產物送上海英駿生物技術有限公司測序。將純化的分離菌接種微量生化反應管，37℃培養48h進行細菌的生化特性測定。應用大腸桿菌血清定型試劑盒對分離的致病性大腸桿菌進行O抗原血清分型。

1.2.3 病毒的檢測

將采集的病羊痘疹結節或痂皮用加有雙抗的生理鹽水研磨，反復凍融3次，4000r/min離心10min，取上清液，應用病毒基因組提取試劑盒提取病毒基因組DNA或RNA，按劉棋等（2006）和向智龍等（2010）方法進行山羊痘病毒和羊口瘡病毒的PCR檢測[6,7]。

1.2.4 衣原體檢測

由于馬山黑山羊均未免疫衣原體疫苗，因此采用血清學檢測方法來判斷病羊是否感染衣原體，檢測方法和判定標準按說明書進行。

1.2.5 寄生蟲和中毒檢測

按蠕蟲學剖解的方法檢查和觀察病羊實質臟器中寄生蟲的蟲體；采用沉淀法和飽和鹽水或糖水漂浮法檢查糞便中蟲體、蟲卵或卵囊的形態。按現場調查，癥狀以及治療的結果進行是否中毒的診斷。

1.2.6 分離病原菌的致病性試驗

將4ml支原體純培養物（3×108CFU/ml)氣管接種于黑山羊，觀察和記錄黑山羊的臨床變化情況，30d后剖解試驗羊。將純化的分離菌接種小白鼠，試驗組每只小鼠腹腔接種0.3ml菌懸液，對照組小白鼠腹腔接種等量PBS作對照。

1.2.7 分離病原菌的藥物敏感性試驗

按李軍等（2011）和秦若甫等（2011）方法進行細菌的藥物敏感性測定[8,9]。

2 結果與分析

2.1 馬山黑山羊主要疫病的病原檢測

通過對81個病例的病原檢測、分離和鑒定，確診細菌感染的病例59例，占全部病例的72.8%（59/81）；病毒感染的病例8例，占9%（8/81）；寄生蟲病12例，占14.8%（12/81）；中毒病2例，占2.5%（2/81）。檢測到的細菌性病原為綿羊肺炎支原體、絲狀支原體山羊亞種、大腸桿菌、綠膿桿菌、奇異變形桿菌、偽結核棒狀桿菌和衣原體；病毒性病原為傳染性膿皰病毒；寄生蟲有擴展莫尼次絳蟲、毛首線蟲等多種園線目線蟲、艾美耳球蟲和肝片吸蟲；中毒病為霉菌毒素中毒，見附表。

附表 馬山黑山羊病例和病原數

在81個病例中，有37個病例是支原體肺炎及其混合感染，占全部病例的45.7%（37/81），其中以綿羊肺炎支原體占多，達34例。對分離綿羊肺炎支原體的山羊致病性試驗表明，攻毒后第2d，山羊出現體溫升高至39.8℃，并維持至高度后第17d；攻毒后第4d開始流鼻涕，第13d開始咳嗽，直至試驗結束仍未康復；剖檢肺臟可見肺淤血，有不同程度出血性 “肝變”，甚至 “胰變”，這表明分離到的綿羊肺炎支原體具有一定的毒力，因此，綿羊肺炎支原體是馬山黑山羊的主要疫病病原。

分離到的大腸桿菌、綠膿桿菌、奇異變形桿菌、偽結核棒狀桿菌對小白鼠均具有致死性，表明這些細菌在感染過程中均有一定的毒力。利用凝集法對分離到的18株致病性大腸桿菌進行血清分型，鑒定出6個血清型，分別是O78（2株）、 O13（5株）、 O15（4 株）、 O20（3 株）、 O101（1 株）、O26（3株），O78能致羔羊和小白鼠發病死亡；O13、O15、O20、O101、O26能引起羔羊黃白痢。檢測到的衣原體病主要是引起流產和結膜炎。

2.2 馬山黑山羊病原菌的藥物敏感試驗

分離到的細菌藥物敏感試驗顯示，只有少數藥物，如環丙沙星、頭孢噻肟、頭孢曲松鈉、左氧氟沙星是敏感藥物，青霉素G、阿莫西林、林可霉素對細菌已經無效。支原體藥物敏感試驗顯示，壯觀霉素、環丙沙星、卡那霉素、阿米卡星、林可霉素、左氧氟沙星、氟苯尼考是高度敏感藥物。

3 討論

臨床病例診治分類調查統計結果顯示，目前危害馬山黑山羊的主要疫病是細菌性傳染病占72.8%（59/81），病毒性疾病占9.9%（8/81）， 寄生蟲病占14.8%（12/81）， 霉菌中毒性疾病占2.5%（2/81）等。在細菌性傳染病中支原體肺炎占62.7%（37/59） （含和寄生蟲或其他細菌的混合感染）；大腸桿菌病占25.4%（15/59）； 衣原體病占6.8%（4/59）， 此外還有偽結核病、綠膿桿菌病和奇異變形桿菌病等。在病毒性疾病中以傳染性膿皰常見，寄生蟲病中以絳蟲和線蟲危害最大。這些疫病是當前馬山黑山羊臨床上常發性疾病，其中支原體肺炎、傳染性膿皰、山羊痘、大腸桿菌病、絳蟲和線蟲病是防控重點。

藥物敏感性試驗結果表明，目前馬山黑山羊的常見病原菌已經對大多數抗菌藥物產生耐藥性，因此，在今后治療時，不能盲目用藥，一定要做細菌的分離和藥物敏感性試驗，選擇對細菌高度敏感藥物，按療程和使用劑量進行治療。

從診治的病例來看，雖然未碰到鏈球菌病、梭菌性疾病、沙門氏菌病、布魯氏病等，但這些疾病在廣西其他地區的山羊中有發病或血清學檢測陽性的報道[10]，同樣要引起我們高度重視。隨著流通的增多、養殖規模的越來越大，導致場地和環境的污染必將會越來越嚴重，條件性致病菌的危害肯定會加大，混合性感染病例會增多，2014年小反芻獸疫在全國各地已經發生，給山羊產業帶來更大的威脅。因此，在平時的養殖過程中，一定要強化飼養管理、增強防疫等綜合性防治措施，政府部門要加強防疫制度的建立，確保疫苗有效供給等，切實有效防止這些疾病的發生。

[1]閉炳芬,陶立,李軍,等.馬山黑山羊支原體肺炎病原的鑒定[J].中國畜牧獸醫,2014,41（9）：249-253.

[2]陶立,藍顯利,閉炳芬,等.羔羊奇形變異桿菌與支原體混合感染的診斷[J].中國畜禽種業,2014(12)：104-106.

[3]陶立,李軍,韋志鋒,等.廣西圈養山羊傳染性胸膜肺炎流行病學調查和綜合防治措施[J].黑龍江畜牧獸醫,2012(1)：98-99.

[4]儲岳峰,高鵬程,趙萍,等.應用雙重PCR方法檢測羊支原體肺炎病原[J].畜牧與獸醫,2009,41（12）：23-27.

[5]陳澤祥,禤雄標,許力干,等.鱉源格氏乳球菌的分離及鑒定[J].現代農業科技,2008(10)：151-154.

[6]劉棋,黃夏,郭建剛,等.山羊痘病毒的分離鑒定及生物學特性的研究[J].中國預防獸醫學報,2006,28（5）：394-398.

[7]向智龍,程振濤,卓建華,等.羊口瘡病毒PCR檢測方法的建立與應用[J].貴州農業科學,2010,38（7）：145-147.

[8]李軍,禤雄標,謝宇舟,等.廣西畜禽大腸桿菌O157：H7流行病學調查[J].中國人獸共患病學報,2011,27（12）：1151-1155.

[9]秦若甫,李智紅,韋志鋒,等.二株綿羊肺炎支原體藥物敏感性試驗和臨床治療體會[J].廣西畜牧獸醫,2011,27（3）：165-166.

[10]陶立,韋志鋒,蘭美益,等.廣西山羊主要疾病流行病學調查[J].中國畜牧獸醫,2010,37（2）：138-140.

廣西水產畜牧局科技項目（桂漁牧科072411，桂漁牧科08283-2）;南寧市科技攻關項目（20132312）。

藍金紅（1970-），女，廣西人，學士，獸醫師，主要從事動物疫病防治工作。

陶立（1964-），男，廣西人，學士，高級獸醫師，從事動物疫病的防治和研究。

楊威（1957-），男，廣西人，研究員，從事動物疫病的防治和研究。

黃明學（1964-），男，廣西人，畜牧獸醫師，從事動物疫病的防治和研究。