中空納米二氧化硅復合微球的制備及其對蛋白的親和分離

田淑芳 鄒雪艷 盧海濤 何建英 陳丹云 趙彥保 郭靜玉

中空納米二氧化硅復合微球的制備及其對蛋白的親和分離

田淑芳1,2鄒雪艷＊,2盧海濤3何建英1陳丹云1趙彥保2郭靜玉1

(1河南大學化學化工學院，開封475004)
(2河南大學特種功能材料重點實驗室，開封475004)
(3河南大學民生學院，開封475004)

利用水熱法合成了中空巰基納米二氧化硅微球(SiO2-SH)，然后在其表面修飾亞氨基二乙酸基團(-IDA)，形成了中空SiO2-SH/IDA雙功能化納米微球。利用該納米微球表面的-SH和-IDA雙功能團，可以更多的吸附溶液中的Ni2+，形成SiO2-SH/IDA-Ni2+復合微球從而可以更好的分離以六聚組氨酸為標簽的(His-tagged)蛋白。結果顯示制備的樣品對分離His-tagged蛋白具有廣譜性，并且具有較好的再生能力。

中空微球；SiO2；蛋白分離；功能化；親和

近年來，隨著納米技術的迅速發展，具有新穎拓撲結構的納米粒子引起了人們的極大興趣[1-3]。其中，中空二氧化硅材料因其具有大比表面積、高熱穩定性和規則孔道結構等優點在催化吸附、分離提純、生物材料、納米材料、環境、能源等領域顯示出廣泛的應用前景[4-6]。特別是無機氧化物(如TiO2、 SiO2、Fe3O4等)中空微球[7-9]，因密度低、熱力學穩定性高等特性備受關注。但在實際應用中，僅僅依靠介孔材料骨架二氧化硅的性能還遠遠不能滿足要求，需要對其表面及孔道進行功能化處理[10-12]。鎳離子親和層析法(Immobilized metal ion affinity chromatography,IMAC)隨之出現[13-16]，它的主要原理為六聚組氨酸鏈(His-tagged)對某些金屬離子(如Ni2+、Cu2+和Co2+)具有親和能力，能夠特異性的固定這些離子，從而達到親和分離的目的。His-tagged蛋白很容易通過微生物細胞進行表達[17-18]，并且通過適當處理，可實現表面修飾金屬離子的再生[19-20]。盡管如此，這些合成方法仍有一定的局限性：通過多步嫁接方式很難獲得高密度的功能化基團，從而導致有限的比表面積和較低的表面金屬離子濃度，最終導致低的蛋白質純化效率。

為了較好的解決這個問題，本文采用一步法直接合成了中空巰基納米二氧化硅微球(SiO2-SH)，并在其表面修飾-IDA基團，使之成為SiO2-SH/IDA雙功能團復合材料，大大提高了表面Ni2+的吸附量。同時由于中空SiO2-SH本身具有較高的比表面積，從而用之分離蛋白具有更大的優勢。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

1.1.1 試劑

巰基丙基三甲氧基硅烷(MPS，95%)購自Alfa-Aesar公司；正硅酸乙酯(TEOS)購自天津市福晨化學試劑廠；十六烷基三甲基氯化銨(CTAC，≥98.0%)購自國藥集團化學試劑有限公司；三乙醇胺(TEA，≥99.0%)，亞氨基二乙酸(IDA，98%)，3-(2，3-環氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷(GPTMS)均購自阿拉丁公司；十六烷基三甲基氯化銨(CTAC，≥99.0%)均購自天津市科密歐化學試劑有限公司。

1.1.2 儀器

樣品的形貌及組成用透射電子顯微鏡(TEM，JEOL JEM-2010型，日本電子株式會社)，傅立葉變換紅外光譜儀(FT-IR，AVATAR360型，美國尼高力公司)，熱重分析儀(TG，TGA/SDTA851e，Merrler-Toledo Instruments公司)進行檢測；捕獲的Histagged蛋白用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(SDS-PAGE，Power PAC 300，鄭州寶賽科貿有限公司)，穩壓電壓是70 V，分離電壓是120 V。捕獲蛋白的含量用紫外-可見分光光度計(UV-Vis，nanodrop 2000c，美國Thermo公司)進行測定，測定波長為400 nm。

1.2 實驗步驟

1.2.1 SiO2-SH的制備

在50 mL燒瓶中加入17 mL水，2.8 mL無水乙醇，0.03 g CTAC，攪拌10 min后加入1.1 mL TEA，繼續攪拌20 min后升溫至60℃，加入1.4 mL TEOS和1.4 mL MPS的混合物，繼續反應3 h。得到的產物轉入50 mL高壓反應釜中，于110℃反應48 h，自然冷至室溫。離心后沉淀用鹽酸乙醇溶液洗滌3次。最后用無水乙醇洗滌3次后于60℃烘干，即得到SiO2-SH樣品。

1.2.2 SiO2-SH/IDA的制備

稱取1.7 g IDA，加入20 mL去離子水溶解在燒瓶中，然后用NaOH調節溶液的pH值為11，在0℃冰浴條件下，邊攪拌邊加入2 mL GPTMS，隨后將溶液加熱至65℃，反應12 h。取3 mL GPTMS-IDA溶液將其pH值調制為2，加入0.1 g SiO2-SH微球，分散后升溫至90℃反應3 h，溶液離心、洗滌后得到SiO2-SH/IDA樣品。

1.2.3 SiO2-SH/IDA微球吸附Ni2+

準確稱取3 mg SiO2-SH/IDA樣品，分散在50 mL的2 mol·L-1NiCl2溶液中，于25℃水浴震蕩反應2 h，之后沉淀用去離子水洗滌6次，分散在1 mL 25%的乙醇中備用，即得SiO2-SH/IDA-Ni2+樣品。

1.2.4 SiO2-SH/IDA-Ni2+微球對His-tagged蛋白的分離

文中分離的蛋白為His-tagged Thioredoxin(Histagged TRX)[20]，來自于PET-32a質體[21]，六聚組氨酸為標簽的重組質體被植入大腸桿菌體內，并用常規的方法進行蛋白的表達[22]。一般來說，所有Histagged融合蛋白都可以用親和分離的方法捕獲分離。蛋白分離的具體步驟如下：首先用1 000μL破菌buffer(20 mmol·L-1Tris-HCl，含0.2 mol·L-1NaCl)洗滌SiO2-SH/IDA-Ni2+復合材料，然后將這些復合材料分散到1 500μL細胞裂解液中，在搖床上(90 r· min-1)4℃孵育2 h。隨后，將捕獲了目標蛋白的復合材料用破菌buffer離心洗滌數次以去除表面殘留的蛋白。最后，捕獲的His-tagged TRX蛋白用一定濃度的300μL咪唑進行洗脫，取適量洗脫后的蛋白進行SDS-PAGE分析。

2 結果與討論

2.1 TEM分析

圖1為制備樣品的TEM圖，從圖中可以看出，制備的樣品為中空微球，內部有多處中空，樣品粒徑均一，分散性好，平均粒徑為90 nm，殼層較厚。

圖1 制備SiO2-SH樣品的TEM圖Fig.1 TEM image of the prepared SiO2-SH sample

2.2 FT-IR分析

圖2給出了所制備的SiO2-SH/IDA樣品的FTIR圖。從圖中可以看出，1 124、801和471 cm-1均有明顯的紅外吸收峰，歸因于Si-O-Si的反對稱及反對稱伸縮吸收峰和彎曲振動吸收峰，說明該樣品的主要成分為SiO2[23-24]。2 550 cm-1處的強峰對應微球中-SH基團的伸縮振動[25]，說明制備的樣品中含有-SH基團。2 926 cm-1為亞甲基的伸縮振動峰，這可能是由于引入-SH或-IDA基團引起的。對比圖2b中SiO2-SH(曲線1)和SiO2-SH/IDA(曲線2)的變化可以看出，曲線2在1 623 cm-1處增加了-NH及COO-的伸縮振動峰，1 528 cm-1處增加了N-HⅡ的面內彎曲振動吸收振動峰[26]，說明制備樣品的表面成功修飾了-IDA基團。

圖2 (a)SiO2-SH/IDA的樣品的FT-IR圖；(b)制備SiO2-SH和SiO2-SH/IDA樣品的FT-IR圖Fig.2(a)FT-IR spectrum of the parpared SiO2-SH/IDA sample;(b)FT-IR spectrum of the preparedSiO2-SH and SiO2-SH/IDA samples

2.3 TG曲線

圖3為制備SiO2-SH和SiO2-SH/IDA樣品的TG圖，從圖中可以看出樣品從室溫～800℃均有明顯的失重，其中室溫～240℃為表面吸附水的失重，而主要的失重出現在240～800℃，從曲線1可以看出樣品SiO2-SH的失重率約為37.9%，這主要為表面巰基的失重率。從曲線2可以看出，樣品SiO2-SH/IDA的失重率為41.7%，這主要是由于表面修飾的-SH和-IDA基團的熱分解所致，說明表面具有較高的官能團密度。對比兩條曲線可以看出，曲線2比曲線1多失重約3.8%，這可能是由于表面-IDA基團的熱分解所引起的。

圖3 制備SiO2-SH和SiO2-SH/IDA樣品的TG曲線Fig.3 TG curve of the prepared SiO2-SH and SiO2-SH/IDA samples

2.4 捕獲蛋白測評

親和分離是一種常規分離蛋白的方法，它的基本原理是利用載體表面的基團與蛋白質進行特異性結合，從而達到分離目標蛋白的效果。從圖4可以看出，樣品從制備到分離His-tagged目標蛋白共需要4步：首先水熱法一步合成中空SiO2-SH微球，隨后在微球表面修飾-IDA基團形成SiO2-SH/IDA，并用其來吸附Ni2+，從而形成SiO2-SH/IDA-Ni2+復合微球，最后將制備的微球直接用于混合蛋白的分離，可將His-tagged融合蛋白從混合蛋白中分離提純。其可能的作用機理為，-SH和-IDA基團對溶液中的Ni2+具有協同作用，可以吸附更多的Ni2+，從而增加表面離子密度，進而更好的分離His-tagged融合蛋白。而傳統的材料中一般只有一種金屬螯合基團，如-IDA、-NTA(氨基三乙酸)、-CM-ASP(羧甲基天冬氨酸)[27-28]。

圖4 制備樣品及分離目標蛋白示意圖Fig.4 Scheme of the synthesis of the sample and separation of the target protein by the prepared sample

為了確定最佳的咪唑洗脫濃度，我們考察了不同濃度洗脫條件下制備的SiO2-SH/IDA-Ni2+復合微球分離His-tagged TRX蛋白的效果，圖5為不同咪唑濃度洗脫下制備微球分離目標蛋白的SDS-PAGE電泳圖,泳道1：混合蛋白；泳道2：0.5 mol·L-1;泳道3：1 mol·L-1；泳道4：2 mol·L-1；泳道5：3 mol·L-1。從圖中可以看出，當改變咪唑洗脫濃度時，隨著咪唑濃度的增加，洗脫目標蛋白的量逐漸增加，當咪唑濃度為1 mol·L-1時，洗脫下來目標蛋白已達到最大，且幾乎沒有雜蛋白。當繼續增加咪唑濃度時(2、3 mol·L-1)，洗脫下來雜蛋白的量也隨之增多，因此，我們以下測試選用咪唑的濃度為1 mol·L-1。

為了測試制備樣品對目標蛋白的檢測限，我們對不同梯度的His-tagged TRX蛋白進行檢測。圖5泳道6～9為不同His-tagged TRX加入量分離蛋白的SDS-PAGE圖：泳道6：His-TRX濃度100μmol· L-1；泳道7：His-TRX梯度10μmol·L-1；泳道8：His-TRX梯度1.0μmol·L-1；泳道9：0.1μmol·L-1。從泳道6～8可以看出，當His-tagged TRX濃度在100～1.0μmol·L-1時，制備的樣品對目標蛋白均有較好的檢測效果，當蛋白濃度為0.1μmol·L-1時，泳道9的條帶較弱，說明樣品對目標蛋白的檢測能力較弱，即制備樣品對His-tagged TRX蛋白的檢測限至少為1.0μmol·L-1，具有較好的響應效果。

圖5 不同咪唑濃度及不同濃度His-tagged TRX蛋白濃度條件下SiO2-SH/IDA-Ni2+復合微球分離Histagged TRX蛋白的電泳圖Fig.5 SDS-PAGE analysis of purified His-tagged TRX proteins by the prepared SiO2-SH/IDA-Ni2+composite NSs in different concentration of imidazole and different concentration His-tagged TRX proteins were used

泳道10為商品凝膠分離混合蛋白的電泳圖，從圖中可以看出，文中制備樣品分離目標蛋白的效果(泳道2)與商品凝膠分離效果(泳道10)相當，由于商品凝膠分離蛋白需要多次過柱子，操作比較繁瑣，所以與之相比，制備樣品分離目標蛋白的操作更簡便、快捷。

為了考察制備SiO2-SH/IDA-Ni2+復合微球的再生能力，我們用EDTA和NiCl2溶液對分離過Histagged TRX蛋白的微球進行處理，然后再用其分離混合蛋白。圖6中泳道1為Marker，泳道2為混合蛋白，泳道3～5分別為第一次再生、第二次再生、第三次再生后復合微球對His-tagged TRX蛋白分離的電泳圖。從圖6可以看出，制備的微球再生3次，仍對混合蛋白中His-tagged TRX蛋白具有較高的分離能力(泳道3～5)，說明此微球具有較強的再生能力。

為了考察制備的SiO2-SH/IDA-Ni2+復合微球分離His-tagged融合蛋白的廣譜性，我們又考察了SiO2-SH/IDA-Ni2+微球對His-tagged Light Oxygen Voltage(His-tagged LOV)蛋白的分離效果，圖7中泳道1為制備的SiO2-SH/IDA-Ni2+樣品從混合蛋白中分離His-tagged LOV蛋白的電泳圖，泳道2為混合蛋白，泳道3為Marker。從圖7可以看出，制備的樣品對His-tagged LOV蛋白仍具有較好的特異性分離效果，能夠從混合蛋白中將目標蛋白分離出來，說明制備的SiO2-SH/IDA-Ni2+樣品對His-tagged的蛋白具有廣譜性[29]。

圖6 SiO2-SH/IDA-Ni2+復合微球循環分離His-tagged TRX蛋白的SDS-PAGE圖Fig.6 SDS-PAGE analysis of purified His-tagged TRX proteins by the prepared SiO2-SH/IDA-Ni2+NSs for four times

圖7 SiO2-SH/IDA-Ni2+復合微球分離His-tagged LOV蛋白的SDS-PAGE圖Fig.7 SDS-PAGE analysis of purified His-tagged LOV proteins by the prepared SiO2-SH/IDA-Ni2+NSs

3 結論

本文中，我們通過一步法直接制備了中空巰基二氧化硅納米微球，然后在其表面修飾-IDA基團，并用其吸附Ni2+，從而形成SiO2-SH/IDA-Ni2+納米微球。利用該微球可以有效的分離His-tagged融合蛋白，操作簡便快捷，對目標蛋白檢測靈敏度高，并且通過再生處理，可實現微球的多次循環利用，具有潛在的市場價值。與商品凝膠分離介質相比，分離目標蛋白操作更簡便、快捷。

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Synthesis of Nanometer Hollow Silica Composite Microspheres for Affinity Separation of Protein

TIAN Shu-Fang1,2ZOU Xue-Yan＊,2LU Hai-Tao3HE Jian-Ying1
CHEN Dan-Yun1ZHAO Yan-Bao2GUO Jing-Yu1
(1College of Chemistry and Chemical Enginerring,Henan University,Kaifeng,Henan 475004,China)
(2Key Laboratory for Special Functional Materials,Henan University,Kaifeng,Henan 475004,China)
(3Henan University Minsheng College,Kaifeng,Henan 475004,China)

Hollow silica nanospheres with thiolgroups(SiO2-SH NSs)have been successfully prepared through a hydrothermal route.Then the SiO2-SH NSs was further modified by conjugating iminodiacetic acid(IDA)to bear dual chelating groups(-SH and-COOH).After chelating Ni2+,these hollow NSs with dual chelating groups were applied to purify histidine-tagged(His-tagged)proteins.Results show thatthese hollow NSs can be widely used to separate His-tagged proteins and have a good reused ability.

hollow microspheres;silica;separation of protein;functionalization;affinity

O613.72

A

1001-4861(2015)07-1329-06

10.11862/CJIC.2015.191

2015-01-24。收修改稿日期：2015-04-25。

河南省教育廳科學技術重點研究項目(No.14B150003)，國家自然科學基金(No.21271062)資助項目。

＊通訊聯系人。E-mail：zouxy182838@163.com