低場核磁共振結合化學計量學方法快速檢測摻假核桃油

王曉玲，吳 晶，譚明乾

(1．遼寧師范大學 化學化工學院，遼寧 大連 116029;2．中國科學院大連化學物理研究所生物技術部，遼寧 大連 116023)

核桃又名胡桃，含有豐富的脂肪即核桃油、蛋白質、碳水化合物和礦物質元素及維生素等［1－3］。核桃油中含有豐富不飽和脂肪酸，包括軟脂酸、油酸、亞油酸和亞麻酸等［4］。不飽和脂肪酸對降低膽固醇和血脂、防止動脈粥樣硬化、血栓的形成等具有積極作用［5－6］。由于核桃油價格高于其他植物油，部分廠商為牟取暴利，向其中添加低價格且色澤相近的其他植物油(如大豆油、玉米油和葵花油等)冒充核桃油出售，以降低生產成本［7］。因此，需要對核桃油的品質進行檢測。目前，油脂的檢測主要有傳統檢測(如感官評價、物理化學指標的評價等)方法［8－9］和儀器檢測(如近紅外光譜、電子鼻、色譜、質譜和同步熒光法等)方法［10－13］，但傳統檢測具有時間長、化學試劑量大、很難在線檢測等不足，而儀器檢測方法則與常規指標的相關系數不高或效果不明顯［8－13］。因此，建立摻假核桃油檢測技術對于核桃油質量監督以及品質控制十分重要。

低場核磁共振技術因具有快速、無損、準確，且無需任何化學試劑等優點，現已廣泛應用于食品行業［14－16］。其檢測原理是通過對處于恒定磁場中的樣品施加射頻脈沖，使氫質子發生共振，質子再以非輻射的方式釋放所吸收的射頻波能量后返回到基態，此為弛豫過程［17］。弛豫過程采用弛豫時間描述，其弛豫時間分別用T2(橫向弛豫)和T1(縱向弛豫)表示［18］。近年來，低場核磁共振技術結合化學計量學方法也逐漸應用于食品檢測行業［19－21］。

化學計量學是將統計學、數學和化學相結合的一門學科，也是將化學體系的測量值與體系的狀態之間建立聯系的學科，其包括主成分分析(PCA)和偏最小二乘回歸(PLSR)等方法［22］。PCA是在保留原始變量信息的前提下，將數據進行轉換、降維，并對降維后的特征向量進行分類。從PCA的散點圖上可以觀察樣品之間的差異［19］。該方法具有計算速度快和識別功能佳等優點。PLSR提供了一種多因變量對自變量的回歸建模方法，可有效地解決變量之間的多重相關性問題，具有預測未知樣品的能力［23］。化學計量學不僅可以簡約數據，而且有助于對測量數據的解釋、判別和預測，適合摻假體系的預測。

本實驗利用低場核磁共振分析儀，以純核桃油及摻入大豆油、玉米油、葵花油的摻假核桃油為研究對象，結合化學計量學方法分析處理樣品的Carr－Purcell－Meiboom－Gill(CPMG)回波數據及實際摻假值，對核桃油品質進行評價，為核磁共振結合化學計量學方法在油脂品質評價和控制中的應用提供實驗依據。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

NM12型核磁共振分析儀(上海紐邁電子科技有限公司)，T－invfit反演擬合軟件，15 mm核磁共振專用測試管。XW－80A旋渦混合器(上海精科實業有限公司);AR2140型電子天平(美國OHAUS公司);Dragonmed移液槍(上海大龍醫療設備有限公司);RE－52C旋轉蒸發器(鞏義市予華儀器有限責任公司)。

純核桃油:采用溶劑法自制。大豆油(福臨門，中糧北海糧油工業(天津)有限公司生產)，葵花籽油(金龍魚，嘉里糧油(遼寧營口)有限公司)，玉米油(福臨門，中糧北海糧油工業(山東菏澤)有限公司)均購于超市。石油醚(北京化工廠，分析純)。

1.2 實驗方法

1.2.1 純核桃油的制備 以高含油率的新疆阿克蘇地區的溫185核桃作為核桃油提取樣品，將核桃剝殼后，利用研缽研磨成粉末，包入濾紙筒中封閉，裝入索氏抽提柱內;在抽提瓶內倒入160 mL石油醚(沸程60～90℃)，并與抽提柱連接;將抽提瓶放入90℃油浴鍋中，抽提10 h;棄去濾紙筒，再回流2次;取下抽提底瓶，倒出石油醚，用旋轉蒸發儀蒸干，再放入105℃烘箱中，烘至恒重。

1.2.2 摻假核桃油的制備 將自制的純核桃油與純大豆油、玉米油和葵花油按不同比例混合，再利用XW－80A旋渦混合器充分混勻，制作多個混合油樣品，大豆油、玉米油和葵花油在核桃油中的體積分數在0～100%范圍內均勻分布，以保證樣品的代表性。

1.2.3 低場核磁共振檢測 取2 mL核桃油樣品裝入4 mL EP管中，再將樣品裝入15 mm的核磁管中，在32℃(儀器工作溫度)下，放入儀器的樣品池中進行檢測。

CPMG序列檢測參數:P1=4 μs(硬脈沖90°脈寬)，P2=8 μs(硬脈沖180°脈寬)，TD=652 814(采樣點數)，SW=200 kHz(采樣頻率)，NS=4(累加次數)，TW=5 000 ms(重復采樣等待時間)，NECH=8 000(回波個數)。每組5個重復樣品，每個樣品重復測定3次，以平均值作為檢測結果。

1.3 數據處理

1.3.1 NMR T2數據處理 NMR弛豫測量得到的圖為自由誘導指數衰減曲線，其數學模型為:M(t)，其中，A表示樣品中第i種成分的信號強度，T表示樣品中第i種成分的橫向i2i弛豫時間，A0為噪聲的信號，M(t)為衰減到時間t時的幅值大小，t為衰減時間。用T－invfit軟件對i個組分進行反演擬合，可得到油樣的多組分弛豫時間T2及數據圖譜。本軟件使用綜合迭代算法，結果為離散型與連續型相結合的T2譜。反演結果為弛豫譜圖、各個弛豫過程的弛豫幅值、其對應的時間常數及其面積分數。

1.3.2 PCA/PLSR處理 利用Unscrambler 9.7軟件對CPMG序列獲得的衰減數據進行處理，并將所得數據用Origin 8.5軟件進行圖形繪制和線性、指數曲線擬合。

2 結果與討論

2.1 單一油樣分析

將同一參數條件下測定的核桃油、玉米油、大豆油和葵花油的CPMG弛豫衰減信號和T2弛豫檢測結果用T－invfit軟件進行T2反演，所得數據通過Origin 8.5軟件做出CPMG弛豫衰減曲線(見圖1)和弛豫圖譜(見圖2)。

由圖1可見，核桃油與大豆油、葵花油和玉米油的CPMG序列回波峰的曲率和信號強度之間存在一定差異。其中核桃油的弛豫衰減速率最慢，除此之外，僅用肉眼很難看出各種純油樣原始弛豫數據的其他差異性和變化趨勢。

從圖2可見，核桃油、大豆油、葵花油和玉米油的T2弛豫圖譜無明顯差別，圖譜上最先出現的峰為T21峰，第2個出現的峰為T22峰。4種純油的弛豫圖譜主要由100 ms左右處的T21峰和300 ms左右處的T22峰組成，說明4種油中有兩種相似的氫質子在外加磁場條件下產生了磁共振信號。油脂的化學成分主要有油酸、亞油酸和亞麻酸等，而橫向弛豫時間(T2)與亞油酸和油酸的比例有關，亞油酸所占的比例越大，則T2越大;亞油酸和油酸的比例相差越大，T21和T22的差值越大［14］。而圖2中4種食用油的T21和T22值相差不大，推測所含的亞油酸和油酸相差不大。

圖2 不同食用油樣品的橫向弛豫時間譜圖Fig.2 Transverse relaxation times of edible oil samples

2.2 摻假油樣分析

在相同參數下，對大豆油、玉米油和葵花油以不同比例摻偽的99個核桃油樣品進行LF－NMR檢測，所得CPMG衰減曲線和T2弛豫圖譜如圖3～4所示。隨著摻假比例的增加，油樣品的回波強度達到零點的速度加快，即弛豫衰減速率增加(圖3)，且T21和T22峰均向左移(圖4)。但未出現文獻中報道的第3個小峰即聚合物的信號峰［14］。

常規的油脂處理方法為通過離散式指數非線性擬合、分布式指數擬合等方法，確定與油脂樣品中極性高聚物的多少具有一定相關性的橫向弛豫時間T2，由于極性高聚物的信號峰面積與油脂的品質直接相關，因此可以利用極性高聚物的信號峰面積評價油脂品質。在油脂樣品弛豫時間的T2譜圖中，若在10 ms前出現1個極性高聚物的小峰，則用于判斷純油脂摻假煎炸老油;若未出現小峰，則反之。然而，本實驗的T2譜圖中，在10 ms前未發現有小的極性高聚物峰。因此，無法利用離散式指數非線性擬合、分布式指數擬合等方法進行定量分析。

圖3 摻假核桃油樣品的CPMG序列回波峰點圖Fig.3 CPMG echo peak amplitudes of adulterated walnut oil samples

圖4 摻假核桃油樣品的T2圖Fig.4 T2plots of adulterated walnut oil samples

目前，很多文獻通過檢測技術與化學計量學相結合的方法來測定摻假樣品，從而判斷摻假變化趨勢和摻假量(或摻假率)［7，22，24－26］。本實驗利用LF－NMR技術與化學計量學相結合的方法對核桃油摻假不同食用油進行定性與定量檢測。

2.3 摻偽油樣的主成分分析

按照“1.2.2”方法配制3種常見形式的摻假核桃油樣品，對檢測所得CPMG衰減數據進行主成分分析，結果見圖5。圖中PC1和PC2后標明了在PCA轉換中得到的主成分1和主成分2的各自貢獻率。貢獻率越大，說明主成分可以更好地反映原來多指標的信息。一般情況下，總貢獻率超過70%～85%的方法即可使用［27］。圖中每一個圈代表這種樣品的整體特性。不同樣品間的品質差異可以通過主成分得分圖上的間隔距離加以表征，其中兩類樣品的間隔越遠，則說明兩者品質特性差別越大。

圖5 不同摻假比例核桃油樣品的主成分1和主成分2得分圖Fig.5 PC1 and PC2 scores of pure walnut oil and different adulteration samples

圖5A中，主成分1和主成分2共保留99%的原始數據信息，其中主成分1包含的信息量為97%，對摻入不同量大豆油的核桃油樣品進行了很好的區分，而且隨摻假大豆油比例的增加，樣品的分布在主成分1軸上從左向右移動。圖5B中，主成分1和主成分2共保留99%的原始數據信息，純核桃油與不同比例摻假樣品在主成分1軸上可以得到很好的區分，表明摻入不同比例玉米油的核桃油樣品與純核桃油樣品間存在明顯的品質差異。對比圖5A，B可以看出，摻入大豆油和玉米油的核桃油樣品的差異可反映在主成分2軸上。圖5C中，主成分1和主成分2共保留97%的原始數據信息，純核桃油與不同比例摻假樣品在主成分1軸上呈從左向右分布的趨勢，并且純核桃油與摻入20%葵花油的核桃油樣品之間區分很明顯，表明摻少量葵花油的核桃油與純核桃油樣品間即存在明顯的品質差異。由此可見，低場核磁共振結合PCA方法不僅可有效辨識純核桃油和不同摻假形式的摻假核桃油，而且還可以表征摻假物質(大豆油、玉米油和葵花油)添加量對核桃油品質特性變化的影響。

2.4 摻偽油樣的PLSR分析

按照“1.2.2”方法配制3種常見形式的摻假核桃油樣品，對檢測所得CPMG衰減數據及實際摻假值進行偏最小二乘回歸以建立預測模型，并用此模型來預測摻假樣品。將99個樣品劃分為校準集和預測集，校準集和預測集的樣品分別為66個和33個。通常選擇合適的主成分因子數，保證殘余偏差最小，使預測模型更準確。如果選擇過多的主成分因子數，則造成數據過擬合現象，校準集均方根誤差(RMSEC)值會很低，從而導致模型無法準確預測樣品，使預測誤差偏高［25］。繪制不同摻假核桃油樣品的殘余偏差與主成分因子數即潛變量因子數(LV)的擬合曲線，結果顯示，摻入大豆油、玉米油、葵花油的核桃油樣品分別選擇3，4，4個主成分因子數，可以保證預測模型的準確性。

通常采用校準集均方根誤差(RMSEC)、預測集均方根誤差(RMSEP)和校準集相關系數(R2)來評價［28］模型的準確性和精確度，RMSEC和RMSEP值越小，R2值越大，則預測模型越準確。不同食用油摻假核桃油預測模型的回歸方程、相關系數、RMSEC和RMSEP見表1。從表1可以看出，3個模型的RMSEC均較低，分別為3.41%，2.43%和2.60%;RMSEP也較低，分別為2.06%，1.72%和2.06%;R2均大于0.99。因此，3種模型均可用來準確預測相應摻假核桃油的摻假率。

表1 摻假核桃油的預測摻假水平的化學計量學模型參數Table 1 Requisite parameters for adulteration level prediction in adulterated walnut oil samples using chemometric models

3 結論

本文以純核桃油及幾種常見摻假形式(摻入大豆油、玉米油和葵花油)的核桃油為研究對象，利用PCA和PLSR等化學計量學方法分析處理Carr－Purcell－Meiboom－Gill(CPMG)序列的核磁共振弛豫數據，研究低場核磁共振技術與化學計量學方法相結合的食用油品質檢測新方法。結果表明:低場核磁共振結合PCA法不僅能夠有效區分和辨識純核桃油和不同摻假核桃油的品質特性，而且可以表征不同食用油添加量對核桃油品質的影響;低場核磁共振結合PLSR法能夠實現對油品摻假率的定量測定。本文為現代油品企業及有關監管部門監測、評價和控制油制品的品質提供了新的研究思路和有效手段。

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