頂空氣相色譜－質譜聯用結合同位素峰形校正檢索技術鑒別芝麻油風味成分

馬育松，王 敬，艾連峰，竇彩云，賈海濤，于 猛

(1．河北出入境檢驗檢疫局，河北 石家莊 050051;2．河北農業大學 食品科技學院，河北 保定 071000)

芝麻油又稱麻油、香油，是以芝麻為原料加工制取的食用植物油［1－2］，其性質穩定，廣泛應用于食品、醫藥、化妝品、金屬及印染等領域［3］。芝麻含油質量分數約為50%(其中油酸和亞油酸占85%，蛋白質約25%)，還含有大量的硬脂酸、棕櫚酸、花生酸和亞麻酸等。由于不飽和脂肪酸含量很高，所以芝麻油有提高腦細胞活力、改善血液循環、延緩衰老等功能［4］。同時，芝麻油還含有多種天然抗氧化劑，包括芝麻酚、芝麻素、芝麻酚林、芝麻素酚、芝麻林素酚和維生素E等［5］，比其他植物油更易保存。由于芝麻油的市場售價遠高于大豆油、棉籽油等常見食用植物油，部分生產及經營者為牟取暴利，在芝麻油中摻入廉價的油脂(如菜籽油、棉籽油、棕櫚油等);或直接用香精和香料勾兌優質油品，以降低生產成本，牟取暴利;甚至將禁用的有毒、非食用的礦物油、桐油、大麻油等摻入油脂中，或將過期變質油品摻入合格油品以次充好［6］。這些行為嚴重侵害了消費者的合法利益并且擾亂了正常的市場秩序，使得芝麻油質量問題越來越受到社會的關注。

芝麻油的風味成分由濃度極低、種類繁多且結構復雜的各種揮發性物質組成，目前普遍采用氣相色譜－質譜(GC－MS)對其風味成分進行分析［7］，該技術利用保留時間和NIST譜庫檢索對目標物進行定性。然而，僅靠譜庫檢索來推斷化合物的元素組成存在很大的不確定性，往往會出現NIST庫檢索匹配率不高，或幾個待選物的匹配率相似等情況。自然界中很多元素(如C，H，O和N等)都有固定的同位素，每種同位素在自然界的豐度為一個固定值，因此可將質譜圖中同位素峰的相對豐度用于精確相對分子質量的校正技術。近年來美國Cerno Bioscience公司利用同位素規律開發出一種軟件(Mass-WorksTM)用于校正計算精確相對分子質量［8］，該軟件通過建立校正函數方程，并將同位素效應、儀器噪音過濾、峰形補償納入函數方程中，經過計算校正質譜輪廓圖，可以在單位分辨質譜上測定精確質量數，并利用其獨有的同位素峰形校正檢索技術(CLIPs)，準確識別目標物的分子式［9］。目前該方法已在藥物分子及代謝產物的鑒定、環境與安全和農獸藥的定性研究中得到應用，但在食用油的定性分析中未見報道。本文采用頂空氣相色譜－質譜法測定了市售芝麻油的揮發性風味成分，利用MassWorksTM技術同時校正精確質量數和同位素峰形，探索了一種在低分辨率單四極桿質譜儀上對芝麻油風味成分進行快速、靈敏和可靠定性分析的方法，為進一步對芝麻油摻偽的鑒別提供了可靠依據。

1 實驗部分

1.1 儀器與設備

Agilent GC－MS 7890A/5975C氣相色譜－質譜聯用儀(配Agilent 7697A自動頂空進樣器，美國安捷倫公司)，20 mL頂空瓶(美國安捷倫公司)。

1.2 芝麻油樣品

實驗用油為石家莊農貿市場或超市購得的50批次芝麻香油。制油工藝包括水代法和壓榨法;原料品種包括黑芝麻和白芝麻;產地包括河北、山東、河南、廣東、坦桑尼亞和山西等地。

1.3 實驗方法

取10 mL芝麻油于20 mL頂空瓶中，用橡膠密封墊及鋁蓋封口，放入頂空進樣器中，按程序加熱平衡后，頂空氣體由GC－MS進行分析。實驗通過優化樣品體積、揮發溫度、平衡時間及程序升溫等條件，選取最佳儀器分析條件。

1.4 儀器條件

頂空程序:頂空平衡溫度200℃，定量管溫度210℃，傳輸線溫度220℃;平衡時間:20 min。

色譜條件:DB－624(60 m×0.25 mm×1.4 μm)毛細管色譜柱;進樣口溫度:250℃;載氣流速:1 mL/min;程序升溫:初始溫度60℃，保持5 min，以10℃/min升至100℃，保持5 min，以5℃/min升至250℃，保持5 min;分流比:5∶1。

質譜條件:離子源(EI)溫度:230℃;四極桿溫度:150℃;傳輸線溫度:250℃;閾值:0;掃描方式:原始掃描;質量掃描范圍:30～400 Da。以全氟三丁胺(PFTBA)標準品為外標對質譜進行校正。

1.5 數據處理

用MassWorksTM校正質量軸和質譜峰形，是獲得精確質量數的關鍵。通過校正，可以將原始的質譜圖轉變為校正質譜圖，并確定目標物的精確質量數;再經過同位素峰形校正檢索技術(CLIPs)實現目標物分子式的準確識別。以MassWorksTM軟件用標記的PFTBA平均質譜圖為基準，對質量軸和質譜峰形進行校正，建立校正函數，PFTBA具有豐富的碎片分布，可對40～550 Da全部的質譜圖進行校正。然后利用MassWorksTM軟件將校正函數運用到芝麻油的一級全掃描Profile質譜圖進行校正計算，獲得目標物的精確質量數，將校正函數應用到GC－MS采集的質譜數據中，以獲得高的譜圖精度并準確識別目標物分子式。

2 結果與討論

2.1 芝麻油的主要揮發性成分

按照優化的實驗條件對芝麻油中的揮發性成分進行分析，得到了揮發性成分的總離子流圖(見圖1)。利用NIST 08標準譜庫檢索對揮發性成分進行初步定性，以MassWorksTM質譜解析軟件對質譜圖進行校正，模擬計算出組分的精確分子質量，經CLIPs檢索得到組分的元素組成。綜合兩種分析方法的結果，并按照峰面積歸一化法計算出各組分的相對百分含量，最終確定市售芝麻油風味成分中的71種化合物，占總檢出化合物的90.2%(見表1)。這些成分主要包括14種醛類、13種吡嗪類、9種呋喃類、5種吡咯類、4種噻唑類、6種酚類、2種吡啶類、2種吲哚類、2種酸類、1種醇類、1種酯類、1種唑類、1種噻吩類、4種烴類、3種酮類和3種含硫化合物。其中，含量較大的4類物質為醛類(37.4%)、酚類(20.1%)、吡嗪類(10.0%)和呋喃類(6.7%)。這些物質的協同作用形成了芝麻油的特有風味。

圖1 芝麻油揮發性成分的總離子流圖Fig.1 Total ion current chromatogram of volatile compounds of sesame oil

醛類物質因感官閾值一般較低，對芝麻油香味的整體貢獻較大。正己醛在醛類物質中含量最高，達12.8%，其次是壬醛、順-2-庚烯醛和反，反-2，4-癸二烯醛。醛類具有脂肪和水果等香氣特征，還可能表現出辛辣的刺激性氣味［10－11］。例如，己醛呈現生的油脂和青草氣及蘋果香味，常存在于蘋果、草莓、茶葉、苦橙、咖啡中。烯醛具有油脂香、清香、果香。壬醛能散發出類似玫瑰花香氣的氣味。

吡嗪類物質具烘烤、堅果香、咖啡、肉香等香氣特征，占芝麻油揮發性風味物質的10.0%，是芝麻油香氣的主要成分［12］。其中，含量較高的吡嗪類物質有2-甲基吡嗪、2，5-二甲基吡嗪、2，6-二甲基吡嗪和2-乙基-5-甲基吡嗪。含氮的吡嗪類物質主要通過美拉德反應生成。吡嗪類物質的香氣感官閾值較低，香氣的擴散性較好，香味濃郁。如甲基吡嗪具有堅果香、霉香、烤香和壤香。

呋喃類物質是芝麻油具有特殊風味的重要因素之一。其中，2-戊基呋喃的含量最高，達到3.4%，其次是5-甲基糠醛、2-糠醇和糠醛。呋喃類物質具焦甜氣味，使含有這種物質的食品呈現濃郁的烤芝麻油香甜味，其中最能體現芝麻油香甜味特征的物質是2-糠醇。

酚類物質的含量較高，其中芝麻酚的含量最高，達到16%，酚類化合物呈現似木香、煙熏香和焦香;含硫類物質也是芝麻油風味成分中不可缺少的一類物質，一般帶有類似新鮮洋蔥的味道，主要通過熱降解含硫氨基酸生成;噻唑類物質所占的比例很低，這類物質在濃度高時有特殊臭味，但濃度很低時具有牛肉香味、爆玉米、堅果、烘烤花生等香氣，可能是半氨酸或胱氨酸分解物與糖的分解產物相互作用的結果;其他幾類化合物，如吡啶類、吡咯類、噻吩類、吲哚類、唑類、醇類、酸類、酯類和烴類等，雖然每類物質個數少，含量低，但也是芝麻油風味成分不可或缺的物質。因此，芝麻油的香味是多種物質協同作用的結果。

表1 芝麻油的主要揮發性成分分析(n=50)Table 1 Identification of main volatile compounds in sesame oil(n=50)

(續表1)

(續表1)

2.2 質譜解析結果的分析

將MassWorksTM軟件和譜庫檢索技術相結合用于未知物的質譜解析，尤其是對于譜庫檢索匹配度不高的化合物，不僅能充分發揮MassWorksTM準確識別元素組成的優勢，而且能快速確定化合物結構，使質譜解析的結果更加可靠。另外，MassWorksTM還可根據其獨有的同位素峰形校正檢索功能(CLIPs)，通過建立元素組成已知的一個或多個離子生成的校正函數，對質譜峰的精確質量數和同位素峰形同時進行校正匹配，以實現對目標物分子式的準確識別，從而大大提高了低分辨質譜定性的準確度［13-16］。例如，34.063 min的5-甲基-1H-吡咯醛，其NIST譜庫檢索結果并不理想，匹配度僅為9.47%，排在檢索結果中的第5位。而在圖2和表2 MassWorksTM的結果中，其分子式排在11個候選分子式的第1位，譜圖準確度為98.583 7%，且得到不飽和度值為4的信息也進一步對結果進行確證，從而實現了目標物分子式的準確識別。由此可見，排序最高的化合物并不一定是目標物，而通過MassWorksTM校正得到的譜圖準確度和質量精度為GC－MS譜庫檢索提供了高度可靠的確證。對于互為同分異構體的正丁醛和異丁醛、正戊醛和異戊醛等物質，MassWorksTM與高分辨質譜儀(如:TOF和Orbitrap)一樣，僅依據精確質量數和元素構成，無法完成對異構體的準確識別，需通過其他方法來輔助確定其結構，文中涉及到的幾種同分異構體，是通過利用各自的標準物質進行色譜分離后，根據不同的保留時間加以確證。

圖2 MassWorksTM測定5-甲基-1H-吡咯醛分子式結果Fig.2 Formula results of 1H-pyrrole-2-carboxaldehyde，5-methyl-by MassWorksTM

表2 5-甲基-1H-吡咯醛的CLIPs檢索匹配結果Table 2 The CLIPs results of 1H-pyrrole-2-carboxaldehyde，5-methyl-

3 結論

芝麻油的風味成分主要為吡嗪、呋喃、吡咯、吡啶、噻吩、吲哚、唑等雜環化合物以及酚類、硫醇、硫醚等化合物，這些化合物對芝麻油的香味有著不同的貢獻，芝麻油的特殊風味是多種成分協同作用的結果。在本文建立的色譜條件下，可以完成對芝麻油中71種風味成分的分析;同時，通過解析芝麻油風味成分的質譜數據可知，僅依靠質譜譜庫檢索來確定未知化合物是不夠的，同位素峰形校正檢索技術通過模擬計算出的精確分子量，可準確地確定化合物的元素組成，不僅彌補了低分辨率四極桿質譜的不足，也為芝麻油揮發性成分的分析提供了新思路。

［1］Sun W，Tang S F．Jiangsu Condiment and Subsidiary Food(孫偉，唐素芳.江蘇調味副食品)，2006，23(5):28－30．

［2］Qin Z，Yang R，Gao G Y，Huang J N，Chen X L，Qu L B．Food Sci．(秦早，楊冉，高桂園，黃紀念，陳曉嵐，屈凌波．食品科學)，2012，33(24):263－268．

［3］Liu X．Food and Fermentation Technology(劉馨．食品與發酵科技)，2010，46(1):105－106．

［4］Huang S X．Friends of the Consumers(黃善香．消費者之友)，1996，(11):39．

［5］Liang D．Food Eng．(梁丹．食品工程)，2011，(2):40－43．

［6］Zhao W，Liu C L，Sun X R，Wei L N，Miao Y Q，Hu Y J.China Brewing(趙薇，劉翠玲，孫曉榮，位麗娜，苗雨晴，胡玉君．中國釀造)，2014，33(3):9－12．

［7］Wang T Z，Yu L，Qiu S C，Chen X J，Cai S Q，Cao W Q．J.Instrum.Anal．(王同珍，余林，邱思聰，陳孝建，蔡淑琴，曹維強．分析測試學報)，2015，34(1):50－55．

［8］Lin L M．Grain Storage(林麗敏．糧食儲藏)，2006，35(3):43－45．

［9］Erve J C L，Gu M，Wang Y D．J.Am.Soc.Mass Spectrom．，2009，20(11):2058－2069．

［10］Wang Y D，Prest H．Chromatography，2006，27(3):135－140．

［11］Liu Q K，Zhou R B．J.Zhengzhou Inst.Technol．(劉乾坤，周瑞寶．鄭州糧食學院學報)，1992，(3):1－14．

［12］Nakamura S，Nishimura O，Masuda H．Agric.Biol.Chem．，1989，53(7):1989 －1991．

［13］Wang Y N，Wang C H，Li W J．J.Agric.Sci.Technol．(王亞男，汪聰慧，李衛健．中國農業科技導報)，2009，11(Suppl 1):39－42．

［14］Liu K，Ma B，Wang Y D．Acta Pharm.Sin．(劉可，馬彬，王永東．藥學學報)，2007，42(10):1112－1114．

［15］Zhou W，Zhang Y Y，Zhou X P．Inspection and Quarantine Science(周圍，張雅珩，周小平．檢驗檢疫學刊)，2010，5:1－5．

［16］Zhang Z，Li W J，Yuan Y R．J.Chin.Mass Spectrom.Soc．(張喆，李衛健，袁友榮．質譜學報)，2010，31:224－226．