全氟丙酸與人血清白蛋白結合作用機制的計算模擬與光譜法研究

易忠勝，王海洋，伍智蔚，張愛茜

(1．桂林理工大學 化學與生物工程學院，廣西 桂林 541004;2．中國科學院生態環境研究中心 環境化學與生態毒理學國家重點實驗室，北京 100085)

全氟化合物(PFCs)憑借其優良的熱穩定性、化學穩定性、表面活性及疏水、疏油性能，被大量應用于紡織、化工、電子、制藥、航空、電鍍行業等領域［1－2］。由于全氟化合物含有具極高化學鍵能(鍵能約為110 kJ/mol)的C—F共價鍵，因此這類化合物普遍具有很高的穩定性，能夠經受很強的熱、光照、化學作用、微生物作用以及高等脊椎動物的代謝作用而不降解，在環境中能持久存在，并能夠富集于生物體內［3］，是一類普遍存在于環境中的污染物質，目前在全球幾乎所有的環境介質中均可檢出，甚至在人體的血液中也有檢出［4］。毒理學研究表明全氟化合物具有多臟器毒性，對人體健康存在潛在威脅［5］。

人血清白蛋白(Human serum albumin，HSA)是人體血漿中含量最豐富的蛋白質，體液中的HSA不僅是維持血漿滲透壓的主要成分，且其內源熒光參與多種內源性物質(如脂肪酸、膽色素、氨基酸、激素)、外源性物質(如金屬離子、藥物小分子等)的存儲和轉運［6］;同時，有機小分子進入人體后，通過血漿的儲存和運輸到達受體部位，進而與HSA發生相互作用，限制其進一步運輸［7］，從而對人體代謝產生影響［8］。利用光譜法研究有機小分子與HSA相互作用具有方便、快速的特點［9］，因而，HSA通常用作研究小分子與大分子相互作用的模型蛋白。

環境中的PFCs主要有全氟羧酸類和全氟磺酸類兩種［5］。其中全氟丙酸是一種含氟精細化工產品，作為含氟農藥、醫藥和聚合物合成的重要中間體，應用廣泛，其化學和生物性質穩定，在自然環境中不易被降解，容易在生物體內富集，威脅人體健康［10］。目前PFCs對人類的毒性效應僅限于人群的流行性病學研究［11］，但PFCs與HSA相互作用的機理仍不甚清楚。本文以全氟丙酸(IPC－PFFA－3)為例，通過計算模擬和實驗分析兩個方面探究其與HSA相互作用的機制(結構見圖1)，以期為研究全氟化合物與HSA的毒理作用提供有用信息。

圖1 人血清白蛋白的二級結構及全氟丙酸的分子結構圖Fig.1 Second structure of human serum albumin(HSA)and molecular structure of pentafluoropropionic acid

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

RF－5301PC熒光光度計(日本島津公司);EL204電子分析天平(梅特勒－托利多儀器(上海)有限公司);PHS－3C精密pH計(上海雷磁儀器廠)。

pH 7.4的0.1 mol·L－1三氨基甲烷－鹽酸緩沖溶液(Tris－HCl);HSA(美國Sigma公司)用Tris－HCl緩沖溶液配制成濃度為1.0×10－5mol·L－1的儲備液;全氟丙酸(IPC－PFFA－3，瑞士AD公司)用Tris－HCl緩沖溶液配制成濃度為1.0×10－3mol·L－1的儲備液;將配好的全氟丙酸稀釋10倍，搖勻，置于4℃冰箱中備用。實驗所用試劑均為分析純，水為二次蒸餾水。

1.2 計算模擬

本文所有的計算工作均在DELL服務器、RedHat Linux 5.0系統上完成。使用Sybyl x1.1軟件進行分子對接，GROMACS4.5.5軟件進行分子動力學模擬，VMD軟件進行分子圖形展示和結果分析。所用的HSA晶體結構(代碼為1N5U)從Brookhaven蛋白質數據庫(http://www.rcsb.org/pdb)獲得，該晶體在同類蛋白質中具有E－value小同源性高的特點。

1.3 光譜法

在10 mL比色管中準確移入1 mL 1.0×10－5mol·L－1HSA溶液和2 mL pH 7.4的Tris－HCl緩沖溶液，用移液槍依次加入1.0×10－4mol·L－1IPC－PFFA－3溶液，用水定容至刻度，搖勻，在設定溫度(291，298，310 K)下恒溫10 min，測定體系的激發波長為280 nm、激發光柵和發射光柵的狹縫寬度為3.0 nm/5.0 nm處的熒光光譜，并檢測Δλ=15 nm以及Δλ=60 nm時的同步熒光光譜，以華法林和布洛芬作為熒光探針測定體系的競爭實驗熒光光譜。

2 結果與討論

2.1 IPC－PFFA－3與HSA復合物構象變化

2.1.1 分子動力學模擬研究 分子動力學模擬可以研究復合物小分子在水溶液中的穩定性及其動力學性質。模擬時間為10 ns時，HSA－IPC－PFFA－3復合物與HSA的相對初始結構偏差(RMSD)隨時間的變化情況見圖2A，其中HSA－IPC－PFFA－3體系的RMSD值低于HSA體系的值且波動較小，這說明IPC－PFFA－3與HSA的結合使HSA體系趨于穩定，兩者結合也更為牢固［12］。從圖2B可以看出，HSA－IPC－PFFA－3體系的均方根波動(RMSF)與HSA體系的RMSF變化趨勢相似，大小有微弱變化，這反映了動力學模擬過程中IPC－PFFA－3的結構域未發生較大的位置變化，但蛋白質殘基的柔性發生改變。從10 ns的回轉半徑(Rg)隨時間的變化情況(圖2C)可以看出，每個系統的Rg值在2 ns后達到相對穩定，表示動力學模擬在2 ns后很快達到平衡。而HSA－IPC－PFFA－3體系的Rg值高于HSA體系，表明IPC－PFFA－3使HSA的緊密度發生變化，結構變得膨脹、松散，導致其空腔增大，進而引起HSA的構象變化［13］。

圖2 IPC－PFFA－3與HSA分子動力學模擬Fig.2 Molecular dynamics of IPC－PFFA－3 and HSA

2.1.2 IPC－PFFA－3與HSA的同步熒光光譜 HSA中氨基酸殘基的最大熒光波長與其所處環境的極性有關，所以可通過觀察HSA的同步熒光光譜來分析蛋白質的構象變化［14］。當Δλ=15 nm時只表現出酪氨酸殘基(Tyr)的熒光特征，當Δλ=60 nm時只表現出色氨酸殘基(Trp)的熒光特性［15］。

圖3 IPC－PFFA－3與HSA相互作用的同步熒光光譜Fig.3 Synchronous fluorescence spectra of HSA obtained in the absence and presence of increasing IPC－PFFA－3

從IPC－PFFA－3與HSA體系的同步熒光光譜圖可以看到，Trp和Tyr的熒光強度均隨著IPC－PFFA－3濃度的增加而下降，說明IPC－PFFA－3對HSA熒光有猝滅作用。Tyr(Δλ=15 nm)熒光峰的最大發射波長始終保持在351 nm處(見圖3A)，而 Trp(Δλ=60 nm)熒光峰的最大發射波長隨IPC－PFFA－3濃度的增加發生微弱的紅移(見圖3B)，波長由351 nm移至352 nm，說明IPC－PFFA－3的加入使HSA中Trp附近的微環境極性增加，減小了疏水性，進而影響了HSA的構象，但對于Tyr附近的微環境無影響。

2.2 IPC－PFFA－3與HSA的相互作用

2.2.1 IPC－PFFA－3與HSA的分子對接 利用分子對接可從理論上模擬預測IPC－PFFA－3與HSA相互作用的結合情況，并可以顯示兩者之間的作用力類型。研究發現藥物分子與HSA的結合位點位于ⅡA和ⅢA，即位點Ⅰ(華法林位點)和位點Ⅱ(布洛芬位點)［16］。計算過程利用CH4，C‖O與N—H為分子探針，自動探測結合位點，將優化后的IPC－PFFA－3小分子與蛋白質HSA的位點Ⅰ和Ⅱ處分別進行分子對接。結果表明位點Ⅱ的Total_Score函數得分較高(SiteⅠ:2.640 3，SiteⅡ:3.565 1)，說明位點Ⅱ對接得到的復合物更穩定。此結果與后文的競爭實驗結果相吻合，由此可以推斷IPC－PFFA－3與HSA的結合部位主要為位點Ⅱ。Total_Score函數主要考慮了氫鍵作用、疏水作用、極性作用和溶劑化等因素。通過結合自由能計算，結果表明位點Ⅱ(ΔG=－21.867 5 kJ·mol－1)與IPC－PFFA－3的結合能力比位點Ⅰ(ΔG=－15.689 4 kJ·mol－1)更強。圖4A，B分別顯示了IPCPFFA－3與HSA在SiteⅠ與SiteⅡ的對接作用，圖4C顯示了IPC－PFFA－3周圍5范圍內的氨基酸殘基(ARG348，ARG485，LEU453，LEU457，LEU387，LEU345，PRO486，PRO384，UNK1，VAL344，SER342，GLU450，MET446，ILE388，ALA449)。從圖4D可以看到IPC－PFFA－3與HSA對接后在SiteⅡ與ARG485，SER342和ARG348以7個氫鍵穩定結合，而位點Ⅰ中IPC－PFFA－3與HSA并未存在氫鍵作用。由此可以推斷IPC－PFFA－3與HSA的位點Ⅱ結合更穩定。

圖4 IPC－PFFA－3與HSA的分子對接圖Fig.4 Molecular docking and detailed view of the interactions of IPC－PFFA－3 and HSA

2.2.2 IPC－PFFAs－3對HSA的熒光猝滅作用 蛋白質中因含有酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸殘基，而具有較強的內源性熒光，當IPC－PFFA－3與HSA結合時可使蛋白質的組成結構發生改變，進而改變蛋白質的內源熒光強度。因此，在模擬人體生理條件下，對一系列含有相同濃度HSA和不同濃度IPC－PFFA－3的溶液進行熒光強度測試。如圖5所示，在298 K下，HSA在352 nm處有1個強熒光峰，隨著IPC－PFFA－3濃度的增加，HSA的熒光發射光譜峰形不變，熒光位置出現輕微紅移(為4 nm)，熒光強度依次降低，說明IPC－PFFA－3進入HSA的疏水腔內發生相互作用形成復合物，引起了HSA構象的變化，最終導致HSA的熒光發生猝滅。

2.2.3 IPC－PFFA－3對HSA的熒光猝滅機理及猝滅常數 熒光猝滅過程可分為靜態猝滅和動態猝滅。動態猝滅是由猝滅化合物分子和具有熒光性質的化合物發生相互作用而產生。靜態猝滅是指猝滅劑分子與能發熒光的分子之間借助分子間力，彼此結合對蛋白質的二級結構產生影響而導致熒光體熒光強度猝滅。動態猝滅過程遵循Stern－Volmer方程［17］:

式中:F0和F分別表示加入猝滅物質前后的熒光值，［Q］為猝滅物質的濃度，KSV為動態猝滅常數;Kq為雙分子猝滅過程速率常數;τ0為未加入猝滅物質時熒光物質本身的平均壽命(約為108s)［18］。由F0/F與［Q］的線性方程，可以得到猝滅物質分子對熒光物質分子的猝滅常數。

圖5 IPC－PFFA－3與HSA的熒光猝滅圖Fig.5 Fluorescence quench titration of HSA with increasing IPC－PFFA－3 concentrations

在溫度分別為291，298，310 K時，考察了依次加入10 μL 1 ×10－7mol·L－1IPC － PFFA －3 后HSA(1×10－6mol·L－1)熒光強度的變化情況。由表1可知，隨著溫度的升高，KSV減小，Kq大于各類猝滅劑對蛋白質大分子的最大分散碰撞常數(2×1010L·mol－1·s－1)，表明IPC－PFFA－3對HSA的猝滅可能是猝滅劑IPC－PFFA－3與熒光物質分子HSA在基態時發生了配合反應，IPC－PFFA－3進入了HSA的空腔內，對蛋白質的二級結構和生理活性產生了影響，從而導致熒光的靜態猝滅［19］。

2.2.4 IPC－PFFA－3與HSA的表觀結合常數及結合位點數 當小分子與大分子結合時，其結合常數與結合位點數由下式求出［20］:

式中n為結合位點數，Ka為表觀結合常數。由lg［(F0－F)/F］與lg［Q］的線性方程，可以得出直線的斜率為結合位點數，截距為lgKa。依據公式(2)得到不同溫度下IPC－PFFA－3對HSA熒光猝滅的雙對數曲線，由該直線的斜率和截距即可求出化合物IPC－PFFA－3與HSA的結合位點數n及表觀結合常數Ka(見表1)。

表1 不同溫度下IPC－PFFA－3與HSA的熒光猝滅常數Ksv、表觀結合常數Ka、猝滅速率常數(Kq)、結合位點數n和相關系數RTable 1 Apparent quenching constants(Ksv)，binding constants(Ka)，quenching rate constant(Kq)，binding sites(n)and correlation coefficient(R)of IPC－PFFA－3－HSA interaction at different temperatures

由表1可知，IPC－PFFA－3對HSA熒光猝滅的雙對數曲線在不同溫度下均具有良好的線性關系(R≥0.994 6)。它們相互作用的表觀結合常數均在105L·mol－1數量級以上。表觀結合常數隨著溫度的增加而減小，從而驗證了IPC－PFFA－3對HSA的熒光猝滅機制是靜態猝滅。結合位點數n≈1，說明在IPC－PFFA－3與HSA作用時可能有1個結合位點。IPC－PFFA－3進入血液后通過人血清白蛋白具有運輸、轉載的特性，將IPC－PFFA－3運輸到人體器官的各個部位，進而產生代謝。而IPC－PFFA－3是一種毒性的小分子，其通過與人血清白蛋白穩定結合而被運輸，進而對人體代謝有一定的影響。

2.2.5 IPC－PFFA－3與HSA的競爭結合位點 研究表明，華法林(Warfarin)和布洛芬(Ibuprofen)與HSA的結合位點分別為SiteⅠ和SiteⅡ［21－22］，具有特異性結合的特點。為了探明PFCs在HSA上的結合位置，本文以Warfarin和Ibuprofen分別作為HSA結合位點(SiteⅠ和SiteⅡ)的分子探針，利用競爭實驗的方法，以確定PFCs在HSA上的結合位置。通過競爭結合實驗，結合修正后的Stern－Volmer方程:

以F0/(F0－F)對1/［Q］作圖，依據直線的斜率和截距可求出表觀結合常數Ka。通過比較加入Warfarin(或Ibuprofen)前后的Ka值可以推斷IPC－PFFAs－3在HSA上的結合位置。

利用公式(3)計算兩者的結合常數Ka值。結果表明未加探針之前IPC－PFFA－3的Ka為1.40×106L·mol－1，加入布洛芬后，Ka變化較明顯(Ka=0.59×105L·mol－1);而加入華法林后，Ka的變化幾乎可以忽略，探針與IPC－PFFA－3結合在各自的作用部位上，由此說明IPC－PFFA－3在HSA上的作用部位均為SiteⅡ，即HSA的亞域ⅢA，與分子對接結果相吻合。

2.2.6 IPC－PFFA－3與HSA的作用力類型 有機物小分子和生物大分子如蛋白質等之間的作用類型主要有靜電引力、范德華力、疏水作用力和氫鍵等。不同的有機物小分子和蛋白質之間結合的作用力類型不同［23］。計算不同溫度下(291，298，310 K)，IPC－PFFA－3與HSA相互作用時的體系熱力學參數結果，見表2。該體系ΔG＜0，說明IPC－PFFA－3與HSA的相互作用是自發進行的，而ΔH＜0，ΔS＜0則表明二者作用力類型為氫鍵［24］，與分子對接結果相吻合。

表2 不同溫度下IPC－PFFA－3與HSA相互作用的熱力學常數Table 2 Thermodynamic parameters of IPC－PFFA－3－HSA interaction at different temperatures

3 結論

本文采用分子對接和動力學模擬對IPC－PFFA－3與HSA的相互作用進行理論推測，并通過光譜法進行驗證，對二者的結果進行對照。結果表明，全氟丙酸小分子與HSA相互作用的方式為熒光猝滅作用，猝滅方式為靜態猝滅。熱力學常數的計算與分子對接結果得出二者間的主要作用力為氫鍵作用力。同步熒光光譜和動力學模擬的結果表明二者間的結合十分穩定，并使HSA的構象發生了改變，毒理作用體現在HSA二級結構的改變，回旋半徑的變大足以說明HSA體系變得膨脹，其二級結構的改變正是由于小分子進入HSA后對其產生的毒副作用所致，而結合力體現在相對初始結構偏差RMSD值的改變，RMSD波動變小說明這兩者的結合趨于穩定。競爭實驗和分子對接、動力學模擬的結果則證明全氟丙酸與HSA的結合位點位于SiteⅡ，說明IPC－PFFA－3對HSA的二級結構產生影響進而改變HSA的二級結構。實驗的結果與理論推測相互驗證，提高了實驗分析的準確度，為今后進一步探究全氟化合物的毒性機理奠定基礎。

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