氧化還原引發制備乙氧酰胺苯甲酯分子印跡微球及其表征

李兆周，李智麗，陳秀金，李道敏，高紅麗，曹 力，侯玉澤，李松彪，牛曉慧，趙振威，趙曉波，陳 慧，陳鳳閣

(河南科技大學 食品與生物工程學院，河南 洛陽 471023)

乙氧酰胺苯甲酯(Ethopabate，ETP)是一種廣譜抗球蟲增效劑，對雞巨型、布氏艾美耳球蟲以及其他小腸球蟲具有較強的殺滅作用，與其他抗球蟲藥物混合使用時不僅可以抑制卵囊，阻斷四氫葉酸的合成，還可以降低抗藥性，提高藥效，因此常被制成復方制劑用于獸醫臨床。2010版《中國獸藥典》(第一部)已收載其原料及制劑，規定其制劑的休藥期為7 d。我國農業部文件《動物性食品中獸藥最高殘留限量》(農牧發 ［2002］235號)規定:ETP在禽肝臟和腎臟中的最高殘留限量為1 500 μg/kg，肌肉中的最高殘留限量為 500 μg/kg［1］。

ETP在畜牧生產中長期大量應用會導致其在動物性食品中殘留，從而對人類健康和環境生態具有潛在危害。建立和完善殘留檢測方法，定期進行監控，是控制其殘留的有效途徑。目前，基于各類生物性抗體的免疫分析方法需要制備結合抗原和有特異性識別作用的抗體，制備過程較為復雜，且分析過程中的穩定性較差，精密度較低。ETP的儀器檢測方法主要有薄層色譜法、紫外分光光度法、高效液相色譜法［2］、高效液相色譜－串聯質譜法等［3］。其中，薄層色譜法操作簡單，常用作定性，但其定量的準確度和靈敏度較低。紫外分光光度法的定量誤差較大，難以排除樣品基質的干擾。色譜法的檢出限較高，難以滿足痕量獸藥殘留和出口貿易檢測的實際需要，而且需進行步驟復雜的樣品凈化和富集［4］。色譜－質譜聯用法的檢測靈敏度高，但價格相對昂貴。由于許多動物性食品的基質較為復雜，干擾物質較多，前處理步驟比較繁瑣［5］。因此，亟需開發選擇性強和效果好的樣品前處理和分析方法。

分子印跡技術能夠獲得在空間和結合位點上與某種分子完全匹配的聚合物，具有構效的預定性、識別的特異性和廣泛的實用性［6］。基于該技術所制備的分子印跡聚合物(Molecular imprinting polymers，MIPs)可以特異性地識別目標化合物，且制備方法簡單，穩定性好，適用于多種環境條件，使用壽命長，可多次重復使用，成本低。針對食品中的有毒有害物質，開發基于MIPs的新型分離介質，建立相應的樣品處理和分析方法，成為一個方興未艾的研究熱點。

傳統的MIPs制備一般采用本體聚合法，操作簡便，對儀器設備條件要求低，但需要研磨、篩分和漂洗等復雜的后處理工藝，所得MIPs的形狀不規則，尺寸不均勻，產率較低，且費時、費力［7］。針對本體聚合的問題，Mayes等［8］提出了懸浮聚合法用于MIPs的合成，此法可以直接生成微球形的MIPs，省去了后處理過程，大大提高了產率和吸附性能，簡化了后處理工藝。在印跡聚合過程中，引發聚合條件是影響MIPs識別性能的重要因素之一，模板和單體所形成的預聚復合體越穩定，則MIPs識別性能越好［9］。懸浮聚合法多采用熱分解引發劑如偶氮二異丁腈［10－11］、偶氮二異庚腈［12］等，在加熱或紫外光照射條件下進行微球的制備［13］，雖能成功聚合，但會影響模板－單體預聚復合體結構的穩定性，尤其是具有熱敏或光敏性的模板分子。采用氧化還原引發體系可以有效解決這一問題，該引發體系能降低生成自由基的活化能，提高聚合反應的速率，進而降低反應溫度，提高聚合物的識別性能［14－16］。

本文選擇氧化還原引發方式，以ETP為模板分子，甲基丙烯酸為功能單體，乙腈為致孔劑，季戊四醇三丙烯酸酯為交聯劑，制備并表征了具有特異性吸附能力的ETP MIPs微球。與常用的熱分解引發劑相比，本文所用引發劑的引發溫度較低，可大幅減少引發溫度對預聚復合體的影響，提高MIPs的特異性和識別能力。所制備的微球狀聚合物能最大限度地減少傳統本體聚合法后處理過程中識別位點的破壞，且具有比表面積較大，分散性和均勻度較好等特點，有利于目標化合物的特異性識別［17］。所制備的MIPs有望用于食品或環境中ETP的快速、靈敏分析。

1 實驗部分

1.1 試劑及儀器

ETP對照品(湖北威德利化學科技有限公司);乙酰苯胺(N-phenylacetamide，NPA)、聚乙烯醇1788、4-氨基苯甲酸甲酯(Methyl-4-aminobenzoate，MBZ)(阿拉丁試劑有限公司);乙腈、甲醇、N，N-二甲基苯胺、過氧化苯甲酰(天津市德恩化學試劑有限公司);甲基丙烯酸(MAA)、丙烯酰胺(AM)、4-乙烯基吡啶(4-VP)、季戊四醇三丙烯酸酯(美國Alfa Aesar公司)。除對照品外，所用試劑均為分析純。

TGL－18C高速臺式離心機(上海安亭科學儀器廠);1260高效液相色譜儀(美國安捷倫公司);FA1004電子分析天平(上海上平儀器有限公司);101－2A電熱鼓風干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司);KQ3200DE超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);DK－8D三孔電熱恒溫水槽(上海一恒科技有限公司);STARe差示掃描量熱儀(瑞士梅特勒－托利多集團);VERTEX 70傅立葉變換紅外光譜儀(德國布魯克公司)。

1.2 分子印跡聚合物的制備

準確稱量1.5 g聚乙烯醇1788加入100 mL蒸餾水，加熱并攪拌至完全溶解，冷卻至室溫后轉入250 mL的四口瓶中，水浴25℃，以400 r/min的轉速攪拌，通氮氣30 min待用。稱取1 mmol ETP至25 mL燒杯，加入功能單體(甲基丙烯酸、4-乙烯基吡啶或丙烯酰胺)、交聯劑(季戊四醇三丙烯酸酯)和致孔劑，超聲5 min混勻;再加入引發劑過氧化苯甲酰和N，N-二甲基苯胺各0.4 mmol，超聲5 min混勻。在氮氣環境下，將混合溶液緩慢滴入四口瓶內，密封，以400 r/min的速度攪拌，水浴25℃引發聚合24 h。聚合反應結束后，將所得聚合物微球離心，棄去上清液，依次用蒸餾水洗滌5次，甲醇洗滌3次，乙醇洗滌3次，每次20 min。將離心的沉淀物于55℃真空干燥后，放入索氏提取器中用甲醇－乙酸混合溶液(9∶1)洗脫至無模板分子被檢出，然后用甲醇洗脫除去殘留溶劑，將MIPs取出，55℃干燥至恒重，以分級篩分級，獲得平均粒徑大小為50～70 μm的ETP分子印跡聚合物［9］。空白分子印跡聚合物(Non－molecular imprinting polymer，NIP)的合成方法除不加模板分子外，其他步驟與上述方法相同。

1.3 掃描電子顯微鏡表征

將MIPs微球加至載物臺上，噴金處理后用場發射掃描電鏡(Field emission scanning electron microscope，SEM)進行形貌觀察并采集照片。

1.4 差熱分析

應用差示掃描量熱法(Differential scanning calorimetry，DSC)分析聚合物微球的熱穩定性，起始溫度25℃，空氣氛圍，升溫速率為10℃·min－1，試樣質量為9 mg。

1.5 紅外光譜測定

采用KBr壓片法，用傅立葉變換紅外光譜儀掃描，獲取MIPs的紅外光譜圖，根據紅外光譜圖中吸收峰的位置、形狀、強度獲得與分子結構有關的信息。

1.6 乙氧酰胺苯甲酯及其類似物分析

在進行吸附性能研究前，須建立底物的定量分析方法。參考文獻報道，本研究采用高效液相色譜法對ETP及其結構類似物NPA和MBZ進行分析［2］。色譜條件:固定相為Angilent Zarbax SB C18色譜柱，250 mm×4.6 mm(i.d.);流動相為乙腈－水(35∶65)混合液;檢測波長268 nm;進樣量10 μL;柱溫為室溫;流速1 mL·min－1。

1.7 吸附性能研究

1.7.1 靜態平衡吸附量 在塑料離心管中加入50 mg的MIPs和5 mL 0.5 mmol·L－1ETP的乙腈溶液，混勻，在25℃下，以200 r/min的速度振蕩24 h，離心后取上清液，用乙腈稀釋10倍，取1 mL注入高效液相色譜儀測定其平衡濃度，依據式(1)計算模板分子的吸附量Qw。

式中Qw為靜態平衡吸附量(mmol·g－1);Cs0為底物起始濃度(mmol·L－1);Cs為吸附平衡時底物的濃度(mmol·L－1);V為底物溶液的體積(mL);m為MIPs的加入量(mg)。

依據靜態吸附實驗結果，計算聚合物微球的分離系數和印跡因子，根據式(2)計算底物在聚合物和溶液兩相中的分離系數K。

式中，Cp為聚合物結合底物的濃度(μmol·g－1);Cs為溶液中底物的平衡濃度(mmol·L－1)。由式(3)計算聚合物微球的印跡因子IF。

其中，Kpmip為MIP的分離系數;Kpnip為NIP的分離系數。

1.7.2 等溫吸附曲線 將5 mL不同濃度的ETP乙腈溶液作為吸附液，在25℃下準確稱取10份50 mg MIPs，測定其對模板分子的吸附量，以吸附量對模板分子的濃度作圖，繪制等溫吸附曲線，將獲得的數據用于式(4)的Scatchard分析［18］。根據Scatchard曲線的斜率與截距求出聚合物的平衡解離常數與最大表觀吸附量。

式中，Kd為結合位點的平衡解離常數，C為模板分子的平衡濃度(mmol·L－1)，Qmax為最大表觀吸附量(mmol·g－1)。

1.8 選擇性評價

選用印跡因子最高的MIPs進行選擇性評價。將50 mg MIPs放入塑料離心管中，分別加入5.0 mL 0.5 mmol·L－1模板分子及其結構類似物的乙腈溶液(對于不溶于乙腈的物質采用甲醇溶解)，置于25℃恒溫氣浴搖床中振蕩24 h，將該混合液在20 000 g轉速下離心15 min，取適量上清液用相應溶劑稀釋10倍，分別測定模板分子及其類似物的平衡濃度，并計算MIPs對不同底物的Qw，K和IF［19］。

2 結果與討論

2.1 聚合條件的優化

采用四因素三水平(L934)正交設計法優化印跡體系，根據所得聚合物的印跡因子篩選最優的反應條件和體系。在對模板分子進行印跡的過程中，致孔劑起著重要作用，既作為溶劑溶解模板分子、功能單體、交聯劑和引發劑，也可以保證所制備的聚合物有合適的孔徑，減少傳質阻力，使模板分子及其結構類似物能夠自由結合識別位點。致孔劑的理化性質與聚合物的性能間有密切關系，其極性越低，越有利于模板分子和單體之間氫鍵的形成。據此，本研究分別選擇乙腈、氯仿和乙腈－氯仿混合溶劑(1∶1)制備印跡聚合物，根據所得聚合物的吸附性能指標優選最佳的致孔劑。此外，模板分子的加入量分別選擇1，2，3 mmol;功能單體分別選擇酸堿性不同的甲基丙烯酸、4-乙烯基吡啶和丙烯酰胺;根據模板分子和功能單體化學結構中的氫鍵作用位點，模板分子與功能單體的摩爾比分別選擇1∶4，1∶6和1∶8(見表1)。

表1 正交實驗因素水平表Table 1 Factors and levels for orthogonal design

不同條件下所得聚合物的IF見表2。其中K1，K2和K3為相應水平所得IF的總和，k1，k2和k3分別為K1，K2和K3的平均值，R為極差。從表可知，不同因素對所得結果影響的順序為C＞B＞D＞A，說明致孔劑的理化性質對模板分子和功能單體之間的非共價鍵相互作用的影響較大，最優的試驗組合為A1B1C3D2，即:當模板分子加入量為1 mmol，功能單體為MAA，致孔劑為乙腈，模板單體摩爾比為1∶6時，所得聚合物的印跡效應最好。依此最佳組合制備MIPs，表征其各項性能指標。

表2 正交實驗設計及結果Table 2 Design and results of orthogonal test

(續表2)

2.2 聚合物微球表面形貌觀察

ETP印跡聚合物微球和空白聚合物微球的電鏡掃描圖片見圖1，由圖可見，聚合物微球形貌規則，表面均勻、平滑，空白聚合物微球的分布較為均勻，粒徑較ETP印跡微球大(見圖1A)，部分ETP印跡微球表面分布有大小不等的孔洞(見圖1B)，可能是由于模板分子的加入抑制了聚合過程中鏈的延伸，致使聚合產物的分子量下降，粒徑變小，分布變寬，表面孔洞增多增大。此外模板分子的加入使反應體系的極性增大，聚合物微球在反應體系中的溶解度下降而過早地沉淀出，這是ETP聚合物微球小于空白微球的另一原因［20］。

圖1 ETP空白聚合物微球(A)與印跡聚合物微球(B)的電鏡掃描圖片Fig.1 Images of ETP NIP(A)and MIP(B)microspheres characterized by scanning electron microscope

圖2 ETP MIP和NIP的紅外光譜Fig.2 Infrared spectra of ETP MIP and NIP

2.3 紅外光譜表征

圖2為印跡聚合物和空白微球的紅外圖譜測定結果，在NIP微球中，由于存在MAA之間的相互作用，使得NIP的紅外吸收強于MIP。在印跡過程中，模板分子的加入打破了單體間的相互作用，從而使得吸收峰明顯減弱。其中，在3 000～4 000 cm－1范圍內的吸收主要反映了氫鍵的形成，該處吸收的差異表明MIP在印跡聚合過程中形成了較強的氫鍵相互作用。圖中1 730 cm－1為MAA分子中C‖O鍵的伸縮振動，在印跡過程中模板分子的—NH與MAA的C‖O基團發生了相互作用，使得C‖O鍵的振動減弱，吸收減少，并發生了輕度藍移。在500～1 500 cm－1之間也出現不同程度的吸收差異，表明模板和單體的相互作用使聚合物分子結構中的多處化學鍵發生了振動頻率和幅度改變，MIP和NIP紅外圖譜的差異證實了印跡效應的存在。

2.4 熱穩定性分析

ETP MIP和NIP微球的DSC圖譜見圖3，當聚合物受熱后，其吸熱逐漸增多，NIP和MIP微球分別在68.6℃和83.5℃達到其吸熱的峰值，隨后吸熱逐漸減少以至幾乎沒有熱量吸收，此吸熱過程顯示上述溫度為聚合物的相變溫度。MIP微球由于加入了模板分子，聚合物的交聯度相對較低，因此其相變溫度也較低。當溫度升至200℃后，聚合物逐漸呈現放熱過程，推測聚合物在此溫度下開始出現不同程度的分解。差熱分析結果表明，聚合物的熱穩定性較好，能夠滿足實驗室和現場檢測環境的需要。

圖3 ETP MIP與NIP微球的DSC圖譜Fig.3 DSC spectra of ETP MIP and NIP microspheres

2.5 聚合物的吸附性能

在研究吸附性能前，建立了ETP及其結構類似物NPA和MBZ的高效液相色譜定量分析方法，依據化合物的濃度(Y，mg/L)及其對應的峰面積(X)繪制標準曲線，進行定量分析［3－4］，結果見表3。由表可知，所得標準曲線的線性良好，檢出限(3倍信噪比)和定量下限(10倍信噪比)能夠滿足吸附性能分析的需要。

表3 ETP及其結構類似物的定量分析結果Table 3 Quantitative analysis results of ETP and structural analogues

依據各底物的定量分析方法，表征最優聚合條件下所得MIPs的吸附性能，將實驗原始數據代入公式(1)～(4)，聚合物的各項吸附性能參數見表4。

表4 ETP印跡聚合物吸附性能表征結果Table 4 Characterization of adsorption properties of ETP imprinted polymer

由表4可知，MIP的吸附能力顯著高于NIP，其印跡因子為4.93，對ETP的吸附能力較強。進一步考察了MIP的吸附動力學曲線(見圖4)。由圖可知，MIP在4 h內對底物的吸附可達到穩態，NIP在2 h內即可達到穩態。這表明氧化還原法引發所得聚合物的傳質阻力較低，較易達到吸附平衡，有利于聚合物對底物的快速識別。

圖4 ETP印跡聚合物的吸附動力學曲線Fig.4 Kinetic adsorption curves of ETP MIPs

圖5為印跡聚合物的等溫吸附曲線。在25℃下，聚合物在0.7 mmol·L－1ETP的溶液中達到飽和吸附，當結合達到平衡后，單位質量MIP的吸附量隨著模板分子濃度的增加而趨于飽和，且顯著高于NIP的吸附量。由圖可見，聚合物的吸附過程符合雙分子競爭吸附的Langmuir模型。隨后的Scatchard分析表明，在MIP上存在兩類位點，一類是能與模板分子特異性結合的位點，對模板分子具有高度的選擇性，存在于聚合物的表面和內部;另一類是非特異性的結合位點。其中MIP高親和力位點的分離系數(KD1)和最大表觀吸附量(Qmax1)分別為 0.061 μmol·L－1和 15.28 μmol·g－1;MIP低親和力位點的分離系數(KD2)和最大表觀吸附量(Qmax2)分別為 0.40 μmol·g－1和 27.12 μmol·g－1。而NIP無特異性結合位點，只有非特異結合位點，因此其達到平衡時的吸附量低于MIP。其分離系數(KD)與最大表觀吸附量(Qmax)分別為0.35 μmol·L－1與 6.90 μmol·g－1。

2.6 聚合物的選擇性研究

為評價聚合物的選擇性，選擇印跡因子最高的MIPs進行選擇性評價實驗，結果見表5。結果顯示，以ETP為模板的MIPs對NPA和MBZ均具有一定的識別能力，印跡因子(IF)在2以上。NPA和MBZ雖然與ETP的結構非常類似，但分子結構上的極性官能團較少，這也可能是聚合物對二者識別能力稍低的原因之一，其次，底物的空間結構也會影響聚合物的識別作用。選擇性評價實驗表明，模板分子的結構和性質對MIPs的識別起決定性作用，這進一步印證了MIPs具有識別性能預定性的特點。

圖5 ETP印跡聚合物的等溫吸附曲線與Scatchard分析Fig.5 Isotherm curves and Scatchard analysis of ETP MIPs

3 結論

本文采用懸浮聚合法制備了ETP MIPs微球，結果表明，在氧化還原劑的引發下，以乙腈為致孔劑，ETP為模板分子，MAA為功能單體，季戊四醇三丙烯酸酯為交聯劑，三者的摩爾比為1∶6∶20時所得聚合物的印跡效應最佳。本研究所得MIPs能夠用于復雜基質中ETP的選擇性識別，研究結果不僅為樣品中ETP前處理和檢測方法的建立奠定了基礎，同時也證實了氧化還原劑引發制備MIPs微球的可行性，豐富了分子印跡技術的應用實踐，為熱和光不穩定模板分子MIPs的引發制備提供了參考。

表5 ETP MIPs的選擇性評價結果Table 5 The results of selectivity assessment of ETP MIPs

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