RGD肽涂層微種植體對Beagle犬骨整合的促進作用

武秀萍，HEE MoonKyung，胡小璐，李 冰，李世峰，馮云霞

（1.山西醫科大學口腔醫院正畸科，山西 太原 030001；2.韓國慶北國立大學齒科學院正畸科，大邱427－724）

穩定有效的支抗控制是正畸治療取得良好效果的關鍵，微種植體作為正畸治療的絕對支抗，正在逐漸被更多的臨床醫師所應用。但是由于受到負載強度和旋轉力等因素的影響，微種植體的使用仍受到其初期穩定性的制約。大量研究［1－3］已經證實：微種植體周圍的骨整合程度是其行使功能的生物學基礎，而影響骨整合的因素有很多，其中種植體表面特性是決定其能否與骨長期結合并行使功能的關鍵因素之一。研究［4－5］顯示：將精氨酸－甘氨酸－天冬氨酸（arg－gly－asp，RGD）肽連接于材料表面可以促進成骨細胞的黏附，進而促進種植體骨整合。目前的研究［4－7］均集中在材料處理和初步體外試驗階段，相關的動物和臨床試驗則開展的較少。盡管已有研究［2，6，8］顯示：鈦材料表面經過物理涂覆RGD后可促進成骨細胞的黏附和鋪展，但多數研究局限于體外細胞實驗，有關動物實驗及種植體周圍骨組織改建方面的報道較少。因此本研究采用物理吸附法將RGD肽修飾到微種植體表面，并植入Beagle犬磨牙區牙槽骨，探討RGD對微種植體周圍骨整合的影響，為提高微種植體的初期穩定性提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和材料 18月雄性Beagle犬6只，體質量約15kg，牙列發育完整，無齲病及牙周病變 ［山西疾病控制中心提供，動物合格證號：SYXK－（晉）－2009－0003］。微種植體36枚（直徑1.5mm，長度7mm）及配套植入設備（西安中邦鈦生物制品有限公司）。

1.2 實驗試劑和主要儀器 RGD（HPLC分析純度不低于95%）、兔抗ColⅠ的多克隆抗體、小鼠抗OC的單克隆抗體、超敏SP鼠／兔試劑盒和DAB顯色劑（博士德生物制品有限公司），2%戊巴比妥鈉、4%多聚甲醛、15%EDTA、組織塊包埋用浸液和HE染色試劑等（山西醫科大學寄生蟲實驗室）。Leica2035組織切片機（德國Leica公司），隔水式電熱恒溫培養箱PYX－PHS（上海躍進醫療器械廠），YD－12C型全自動生物組織脫水機（浙江金華益迪醫療設備廠），光學顯微鏡（日本Olympus公司），NikonEM1200照相顯微鏡和S－450型掃描電鏡（SEM）（日本日立公司），BI－2000醫學圖像采集分析系統（成都泰盟科技有限公司），Image ProPlus 6.0圖像分析系統（美國Media Cybemetics公司）。

1.3 RGD肽涂層微種植體的制備和電鏡觀察將消毒好的微種植體在RGD肽溶液（1g·L－1）中完全浸沒，室溫下在密閉容器中保持24h，然后用PBS緩沖液沖洗3次，自然風干以備用，在電鏡下觀察微種植體表面形貌。

1.4 實驗分組和脫鈣標本制備 實驗分組：選擇雙側上頜第2、3和4前磨牙根間（即正對前磨牙尖下距離齦緣約6mm處）為微種植體的植入部位。分別于第0、4和6周在每只Beagle犬的左右上頜隨機植入有RGD涂層和無涂層的微螺釘各1枚。最終每只犬的每側3個植入部位，隨機分配設計植入2、4和8周愈合時間的微種植體，實驗組和對照組各18枚微種植體。

脫鈣標本制備：以助攻方式植入，以直徑為1.0mm的引導鉆預先在植入區形成植入孔道（0.9%生理鹽水冷卻），并且孔道長度與種植體長度相當，再緩慢將微種植體旋入釘道中，減少植入過程對涂層的摩擦。植入術后3d，青霉素80萬U肌肉注射，種植區以3%雙氧水、0.9%生理鹽水交替沖洗。每天檢查微種植體有無損壞和脫落。8周后過量麻醉處死所有實驗犬，取下帶種植體的上頜骨，制備約2.0cm×1.0cm×1.0cm的組織塊，常規脫鈣脫水，將種植體小心拔出，石蠟包埋后沿種植體－骨縱截面5μm連續切片。

1.5 組織學觀察 HE染色：將石蠟切片進行常規HE染色，光鏡下觀察微種植體骨界面及周圍骨組織改建情況。免疫組織化學染色：采用免疫組織化學SABC法，嚴格按ColⅠ和OC試劑盒使用程序進行，DAB室溫顯色，蘇木素輕度復染，常規脫水，透明，封片，顯微鏡觀察。對照組采用0.01mol·L－1PBS代替一抗染色，鏡下觀察ColⅠ和OC染色情況。

1.6 ColⅠ和OC表達水平測定 利用BI－2000圖像采集系統及Image－ProPlus 6.0圖像分析系統。在400倍鏡下測量部位隨機選擇5個視野，測定ColⅠ和OC陽性表達強度，以3次測量的透光度強度進行灰度值測定。以灰度值反映ColⅠ和OC表達水平，灰度值越大，表達水平越高。

1.7 統計學分析 采用SPSS 17.0統計軟件包進行統計學分析。2組不同時間點微種植體周圍骨組織中ColⅠ和OC表達灰度值以表示，組間比較采用單因素方差分析，不同愈合時間組間比較采用SNK檢驗。

2 結 果

2.1 微種植體表面掃描電鏡下觀察和手術植入經RGD肽涂層后的微種植體表面可見較為均勻的粗糙表面（圖1A），對照組微種植體表面較為光滑（圖1B），二者形貌明顯不同。微種植體植入上頜骨第2、3和4前磨牙根分叉區后，微種植體穩定無松動（圖2A，見插頁四），實驗8周后去除微種植體周圍黏膜組織，可見微種植體頸部完好，骨組織無劈裂（圖2B，見插頁四）。

2.2 2組微種植體周圍骨組織形態學 HE染色結果顯示：2周時，實驗組微種植體周圍出現核深染的骨細胞，可見明顯的成骨反應，尚有部分纖維結締組織；對照組也可見成骨反應，但不如實驗組活躍，有大量成纖維細胞及骨吸收，紅細胞滲出。4周時，實驗組未見纖維組織，微種植體周圍骨細胞增殖旺盛，密集處成骨細胞伸展充分，功能活躍；對照組亦出現大量骨細胞，但不如實驗組密集，仍可見部分未被吸收的纖維組織。8周時，實驗組出現層板狀骨，在原有骨組織和新骨之間可見一條明顯的新生線，骨基質中有大量成熟骨細胞；對照組亦可見新生線，新形成的編織骨也趨于成熟，部分轉變為層板狀骨，但不如實驗組的新骨密度均勻，仍可見少數纖維組織和早期幼稚骨細胞。見圖3（插頁五）。

圖1 微種植體表面電鏡觀察（×200）Fig.1 SEM observation of micro－screw implant surface（×200）

免疫組織化學染色顯示：ColⅠ在微種植體－骨界面新生的骨組織、成骨細胞胞漿和未分化的間充質細胞胞漿中均有表達，免疫組織化學染色呈陽性；OC在各組微種植體－骨界面的骨組織中免疫組織化學染色呈棕黃色染，具有廣泛表達；而與不同時間實驗組與對照組比較，ColⅠ及OC的免疫組織化學染色較深。見圖4和5（插頁五）。

2.3 2組微種植體周圍骨組織中ColⅠ和OC表達水平 愈合2和4周時，實驗組微種植體周圍骨組織中ColⅠ和OC表達水平明顯高于對照組（P＜0.05），8周時，2組ColⅠ和OC表達水平比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

實驗組愈合4周時微種植體周圍骨組織中ColⅠ表達水平高于2和8周時且差異有統計學意義（P＜0.05）。對照組4周與2和8周時比較差異無統計學意義（P＞0.05），僅2周與8周時ColⅠ表達水平比較差異有統計學意義（P＜0.05）。實驗組與對照組微種植體周圍骨組織中OC表達水平均隨愈合時間延長而逐漸升高，8周時表達水平均明顯高于2周時（P＜0.05），實驗組愈合4周時OC表達水平明顯高于2周時（P＜0.05），而對照組OC表達水平2周與4周比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 不同愈合時間2組微種植體周圍骨組織中ColⅠ和OC表達水平Tab.1 Expression levels of ColⅠand OC around micro－screw implants in two groups at different healing time（）

表1 不同愈合時間2組微種植體周圍骨組織中ColⅠ和OC表達水平Tab.1 Expression levels of ColⅠand OC around micro－screw implants in two groups at different healing time（）

＊P＜0.05 vs control group；△P＜0.05 vs 2weeks；#P＜0.05 vs 4weeks.

Group Gray value of ColⅠGrayvalue of OC 2 4 8 Control 67.76±3.05 79.16±2.33 72.16±2.14△ 70.78±2.35 86.89±2.63100.76±1.28（week）2 4 8△Experimental 86.32±2.47＊ 91.88±1.96＊△73.83±1.49△# 74.94±1.81＊ 94.15±1.93＊△102.33±2.15△

3 討 論

RGD多肽是由RGD組成的一段短肽序列，廣泛存在于細胞外基質（ECM）中，被認為是目前促進細胞黏附最有效且應用最廣泛的多肽序列［8－10］。在金屬鈦表面連接RGD肽生物涂層的方法有復合涂層、化學偶聯和物理吸附等，但各種方法均存在一些不足，化學偶聯過程中引入的化學物質不僅可能產生生物學危害而且對材料表面形貌易造成影響，層層自組裝利用靜電作用層層吸附帶異種電荷電解質的方式進行修飾，但由于RGD肽相對分子質量小所帶電荷很少，因此單純依靠自組裝技術材料表面得到的RGD含量較少。物理吸附通過非共價鍵吸附于材料表面，操作簡便，盡管RGD存在厚薄不一，穩定性及重復性較差的問題［11］，但仍有研究［8，12－14］證實這一方法可以促進骨量增加，由于支抗微種植體在臨床使用為暫時支抗，僅在治療過程中某個階段使用，隨著治療結束，微種植體將被取出。因此在提高微種植體初期穩定性前提下，并不需要完全的骨整合及永久的穩定性。因此本研究采用操作方便、安全的物理涂覆法，通過改變微種植體植入方式，并以手動緩慢旋入預備的釘道，以減少RGD的擦除。

ColⅠ屬于纖維性膠原，是ECM中最主要的成分，具有良好的生物相容性和低免疫原性［15］，可在體內自組裝成纖維，是成骨細胞增殖早期階段的表達指標。OC則是由成熟的成骨細胞合成和分泌的一種骨非膠原蛋白，參與調節新骨生成和骨改建過程，是成骨細胞向礦化期分化的主要判斷依據之一［16－17］。OC水平越高，說明細胞分化的程度越高。故本實驗選擇ColⅠ和OC作為判斷骨整合的生化指標。

研究者［18］將鈦片浸入 RGD溶液中，發現RGD能促進成骨細胞對鈦片的黏附。這種附著不僅僅表現在細胞的數量上，同時也反映在細胞結構的改變上，RGD促進了細胞骨架內肌動蛋白和紐蛋白的分布、加速細胞在材料表面的附著和鋪展，提高細胞的增殖率［9－10］。本實驗結果顯示：微種植體植入2周時，實驗組微種植體周骨組織中ColⅠ及OC表達水平高于對照組，由于ColⅠ 具有促進細胞與ECM和細胞－細胞間黏附的特性，從而可以推測RGD可以促進ColⅠ 早期表達，從而促進了成骨細胞早期附著和鋪展，使實驗組RGD涂層的微種植體成骨反應遠比對照組明顯。微種植體植入4周時，實驗組ColⅠ和OC表達水平也高于對照組，這種顯著差異一方面由于RGD使ColⅠ的表達增多導致成骨細胞附著和鋪展的加速，勢必帶來成骨細胞分化成熟的提前；另一方面推測RGD也有促進OC表達的功能，對成骨細胞的增殖和分化具有正向調節作用，給種植體表面成骨提供有利條件。該結果與國內外學者的相關研究［9，12－13］結果一致。微種植體植入8周，由于此階段骨的形成和吸收已基本達到動態平衡，ColⅠ和OC的表達水平2組間比較差異無統計學意義，可以推測RGD主要是在種植體植入早期發揮促成骨能力。免疫組織化學分析結果顯示：ColⅠ的表達出現在愈合2周時，4周時達到最高，隨后逐漸減弱；而OC在愈合的前4周一直增殖旺盛，之后維持較高水平，提示ColⅠ和OC可能在成骨細胞分化成熟的不同階段發揮不同作用，代表了不同的骨愈合程度，尚需要進一步的研究證實。

綜上所述，本實驗采用RGD多肽對微種植體進行修飾，通過組織學及生物化學檢測發現RGD可以在加速種植體周圍骨整合的速度、提高微種植體周圍早期骨整合程度和縮短療程等方面發揮積極作用，本實驗為更好地應用微種植體、實現微種植體的早期穩定尋求了一條有效途徑，并為建立RGD修飾微種植體提供了實驗依據。

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